罗瑞涟（佛山市质量计量监督检测中心  广东佛山  528225）

摘 要：本文研究并建立了牛奶中四环素、土霉素、金霉素和强力霉素这4种四环素类兽药的盐析液-液微萃取-超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）的检测方法。牛奶样品经Na₂EDTA-Mcllvaine 缓冲液提取，在硫酸铵辅助下采用乙腈萃取浓缩后，以0.1%（V/V）甲酸水溶液和乙腈为流动相梯度洗脱，经BEH C₁₈柱分离，电喷雾正离子扫描，多反应监测模式（MRM）检测，外标法进行定量。结果显示，该方法下4种四环素类兽药的最低检出限为0.71μg/kg；4种化合物在1～100μg/kg浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999；在1、5、50μg/kg加标水平下回收率为81.71~109.06%，相对标准偏差均小于8%。本方法简单快速、灵敏度高，经济可靠，环境友好，适用于牛奶中四环素类兽药的定性定量分析。

关键词：盐析液液萃取；超高效液相色谱-串联质谱法；四环素类兽药

目前，牛奶中四环素类兽药的检测方法主要有液相色谱-紫外检测法^[、高效液相色谱-串联质谱法^[6]和超高效液相色谱-串联质谱法^[7]。样品中四环素类兽药的提取净化方法主要有固相萃取法和液-液萃取法。近年来，在液-液萃取法的基础上，又衍生出了盐析液-液萃取法。这种方法是向样品溶液和强极性有机溶剂组成的混合物中加入适当的盐类化合物，促使有机溶剂更好地从混合物中分离出来^[8]。该方法简单、快速，在大大减少有机溶剂使用量的同时，能够提高像四环素类兽药这类极性化合物的萃取效率。

一、材料与方法      

1.材料与试剂

盐酸四环素（Tetracycline hydrochloride，97.7%）、盐酸土霉素（Oxytetracycline hydrochloride，97.5%）、盐酸金霉素（Chlortetracycline hydrochloride，93%）、盐酸强力霉素（Doxycycline hyclate，98%），4种标准品购于Sigma公司。

乙腈、甲醇、甲酸，购于德国CNW公司，均为色谱纯。

乙酸乙酯、乙腈、十二水合磷酸氢二钠、一水合柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠、硫酸铵、草酸铵均为分析纯。

牛奶，由佛山市南海区水牛奶研究开发有限公司提供。

2.仪器与设备

Quattro Premier XE超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪(UPLC-MS/MS)，美国Waters公司；OA-SYS水浴氮吹仪，美国Organomation公司；电子天平；旋涡混合器；超声波清洗器；振荡器；离心机。

3.实验方法

(1)溶液配制

Na₂EDTA-Mcllvaine 缓冲液：分别称取2.10g柠檬酸和2.84g磷酸氢二钠，用水溶解并定容至100mL；将100mL0.1mol/L柠檬酸溶液与62.5mL0.2mol/mL磷酸氢二钠溶液混合，并加入6.05g乙二胺四乙酸二钠，使其溶解，摇匀，必要时用氢氧化钠或盐酸调pH至4.0±0.05，即得0.1mol/L的Na₂EDTA-Mcllvaine 缓冲液。

标准溶液配制：分别精确称取4种四环素类兽药标准品2.5mg，用甲醇溶解并定容至25mL，配制成质量浓度为100μg/mL的标准储备液，于-18℃下避光保存。根据需要用50%乙腈水溶液逐级稀释，配制成合适浓度的混合标准工作液。

(2)样品溶液的制备

称取1g样品置于50mL离心管中，添加5mL Na₂EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液，于旋涡混合器上充分混匀后，置于超声波清洗器中超声20min。然后，加入5mL乙腈，置于振荡器上振荡混匀15min。随后，加入5g（NH₄）₂SO₄，涡旋混匀后，4500rpm离心5min，上清液于50℃下N₂吹干。残渣用1mL50%乙腈水溶液溶解定容，过0.22μmPTFE滤膜，滤液供超高效液相色谱-串联质谱仪测定。

(3)UPLC-MS/MS检测条件

UPLC条件：色谱柱：Acquity UPLC BEH C₁₈，1.7 μm，100×2.1 mm；柱温：30 ℃；进样体积：5 μL；流动相：A为0.1%的甲酸水溶液，B为色谱纯乙腈；流速：0.2 mL/min；采用梯度洗脱，洗脱程序列于表1。

质谱参数：电离方式：电喷雾正离子(ESI+)模式；毛细管电压：2.5 kV；离子源温度：120 ℃；脱溶剂温度：300 ℃；脱溶剂气流：N2，流速500 L/h；锥孔气流：N2，流速50 L/h；碰撞气：氩气，流速0.12mL/min；扫描模式：多反应监测(MRM)。

二、结果与讨论

1.质谱条件的优化

本实验在调谐条件下通过注射器直接进样，分别对1μg/mL的各个标准溶液进行母离子和子离子扫描，确定定量和定性离子对，对毛细管电压、锥孔电压、碰撞能和驻留时间等参数进行了优化，表2列出了主要的优化参数。4种四环素类兽药混标的总离子中可看出 4种兽药在4min内即可实现快速分离检测。

2.提取条件的优化

液-液萃取方法中，有机萃取溶剂的选择至关重要。在日常的食品安全检测中，常用的有机溶剂有甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮等。本文选取了乙腈和乙酸乙酯作为研究对象，按照1.3.2的方法处理样品，通过目标化合物的平均回收率来评价两者的萃取效果，结果见图1。从图中数据可见，采用乙腈作为萃取溶剂时，4种四环素类兽药的平均回收率较高，说明相比于极性较弱的乙酸乙酯，具有强极性的乙腈萃取含有极性基团的四环素类兽药的效果更好。而且，乙腈还具有沉淀蛋白质的能力，能够提高净化效果。

        图1 不同有机溶剂的萃取效果                     图2不同类型铵盐对相分离程度的影响

    不同类型的铵盐对液-液微萃取过程中相分离的程度存在一定的影响。铵盐相比于其它盐类，在电离室能够轻易挥发或分解，从而避免对质谱造成损害，是一类质谱友好的盐类化合物^[3]。本文研究了硫酸铵和草酸铵在液液萃取方法中对相分离程度的影响。从目标化合物的加标回收率实验结果图2可见，硫酸铵在液-液萃取过程中，能更好地促进乙腈和水相的分离，从而提高目标化合物的萃取效率，而且回收率的重现性也比草酸铵的要好。

根据国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)对检出限的定义，本实验在阴性牛奶中添加低浓度的混合标准溶液，使各标准品浓度水平分别为0.5μg/kg和1μg/kg，按1.3.2的方法处理，每个水平平行测定6次，计算标准偏差，以3倍标准偏差计算各个化合物的检出限(置信水平P=95%)，最终选取检出限最低的化合物所对应的结果作为本方法的检出限^[2]。结果显示，这两个水平的检出限分别为0.71μg/kg和0.95μg/kg。然后，向阴性牛奶中添加0.71μg/kg的混合标准溶液，按照1.3.2中的方法验证，结果显示4种四环素类兽药在超高效液相色谱-质谱联用仪上仍然有响应，且信噪比S/N>3，因此，确定本方法的检出限为0.71μg/kg。

三、结论

本文研究了盐析液液萃取-超高效液相色谱-串联质谱法检测牛奶中四环素、土霉素、金霉素和强力霉素这4种四环素类兽药的检测方法。该方法下4种四环素类兽药最低检出限为0.71μg/kg；4种化合物在1~100μg/kg质量浓度范围内线性相关性较好，相关系数均大于0.999；在1、5、50μg/kg加标水平下平均回收率为81.71~109.06%，相对标准偏差均小于7%，满足四环素类兽药日常检测工作的需要。本方法简单快速、经济可靠、灵敏度高、环境友好，适用于牛奶中四环素类兽药的定性定量分析。

参考文献：  

[1]中华人民共和国农业部.中华人民共和国农业部公告第235号[EB/OL].2011-07-30

[2]GB/T 22990-2008牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定液相色谱-紫外检测法[S].北京:中国标准出版社，2008

[3]连英杰、吴敏、黎翠玉等.直接提取-超高压液相色谱-电喷雾串联质谱法检测原料奶及奶制品中的四环素类抗生素[J].食品安全质量检测学报，2013.4(2):489-495

作者简介：

罗瑞涟（1991--）女，硕士，主要从事食品风险检测的工作。

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