段　 链/吴　 珍/程义斌/金银龙*

(中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所，北京  100020)

A comparison study among the three indexes of evaluating the copper intake in rats

DUAN Lian，WU Zhen，CHEN Yi-bing，JIN Yin-long*

(Institute for Environmental Health and Related Product Safety of China CDC, Beijing 100020, China)

【摘要】 目的： 筛选出对于铜摄入量敏感的指标，用于微量元素铜的健康影响评价。方法： 灌胃给予大鼠不同剂量 (0、0.033、 0.169、0.829、4.146、20.73 mg/kg)葡萄糖酸铜，90 d后测定大鼠血中铜含量、血中铜蓝蛋白活力及肝中铜含量，并进行比较研究。结果： 随着铜摄入量的增加，各组大鼠血铜含量变化不明显，与正常对照组相比差异无统计学意义(P > 0.05)。相关性分析表明，大鼠血中铜蓝蛋白活力随着铜摄入量的增加而上升，铜蓝蛋白活力与铜摄入量之间呈对数正相关(R2=0.984 5， P < 0.05)；大鼠肝铜含量随着铜摄入量的增加呈现直线上升趋势 (R2=0.989，P < 0.05)。 结论： 大鼠血中铜蓝蛋白活力水平及肝铜含量，均可以敏感反映出不同剂量组大鼠铜摄入水平，但血中铜蓝蛋白活力的测定方法简便，更适宜应用于大量样本的研究中评价铜摄入水平。

【关键词】  铜；血铜含量； 肝铜含量； 血浆铜蓝蛋白

 中图分类号： R589.9      文献标识码： A      文章编号： 1004-616X(2011)02-0141-04      doi: 10.3969/j.issn.1004-616x.2011.02.014

【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To obtain the sensitive index to estimate copper intake in the assessment of its impact on health. METHODS：Comparative study by determining the contents of copper in blood， and liver and ceruloplasmin(CP) activity of the rats treated by copper gluconate at different dosages (0，0.033，0.169，0.829， 4.146，20.73 mg/kg) for 90 days. RESULTS：The content of copper in blood did not change significantly in each group with the increase of copper intake， and no statistical difference compared with normal control group (P > 0.05).  Correlation analysis showed that CP activity rose with increasing copper intake and showed a positive logarithmic correlation (R2=0.9845，P < 0.05).  The content of copper in the liver  showed a linear ascending trend parallel with copper intake (R2=0.989，P < 0.05).  CONCLUSION： A good dose-dependent relationship was shown between the level of CP activity and copper intake， and between the content of liver copper and copper in rats. The level of CP activity and the content of liver copper in could reflect the level of copper intake at different dosage groups. Determination of CP activity is easier and the sample can be acquired easily， so is more appropriate to be used to evaluate  copper intake in the research with large number samples.

【KEY  WORDS】 copper；copper in blood；copper in liver；ceruloplasmin

铜是与人类关系非常密切的有色金属之一，也是人体内一种必需的微量元素，人体每天从食物中摄入大约2~4 mg铜，铜摄入过高或者过低均会对健康产生影响[1]。因此，近来对铜摄入量的健康影响评价研究倍受关注[2]。而选择敏感的指标来评价机体对铜的整体摄入水平是这些研究中的一个关键。

正常人体内血循环铜占总铜量的10%，血浆中约95%的铜与球蛋白牢固结合成铜蓝蛋白，与蛋白结合的铜是运输、吸收、排泄的重要形式。而肝脏是铜的毒副作用的靶器官，是人体内铜含量最高的组织[3]。因此，本研究采用大鼠作为研究对象，在不同剂量铜摄入条件下，对大鼠血中铜含量、血中铜蓝蛋白(ceruloplasmin ，CP)活力及肝中铜含量进行测定，筛选出对铜摄入量敏感的指标，用于微量元素铜的健康影响评价中，作为判断铜摄入量的评价指标。

1　材料与方法

1.1　主要试剂与仪器

铜蓝蛋白(CP)测试盒(南京建成生物工程研究所)，全血稀释液(MB5微量元素分析仪专用，北京普析通用仪器有限责任公司)。MB5型血液微量元素分析仪(北京普析通用仪器有限责任公司)，Thermo SOLAAR M6原子吸收光谱仪(美国热电公司产品)，7200型分光光度计(UNICO，尤尼柯上海仪器有限公司)。

1.2　实验方法

1.2.1　葡萄糖酸铜配制  大鼠正常平均日摄入量(average daily intake，ADI )[4]为饲料中铜含量(正常饲料中铜含量为6.76 mg/kg)×大鼠日进食量(200 g体质量大鼠日进食约25 g)= 6.76 × 0.025/0.2 = 0.845 mg/(kg·d)。

称取淡蓝色葡萄糖酸铜粉末1.47 g，溶于100 ml去离子水中，充分溶解、混匀，配成浓度为14.7 mg/ml的葡萄糖酸铜溶液，其中铜离子浓度为2.073 mg/ml，为25倍平均日摄入量即25 ADI组灌胃试剂。按1 ml/100 g 体质量进行灌胃，即该组大鼠铜摄入量为20.73 mg/kg。取25ADI组葡萄糖酸铜溶液20 ml，加入80 ml去离子水，充分混匀，即得5 ADI组灌胃试剂，此后依此法稀释，分别得到25 ADI组、5 ADI组、ADI组、1/5 ADI组、1/25 ADI组灌胃试剂。

1.2.2　动物分组及样品采集  35只清洁级6周龄Wistar大鼠，体质量99.0~103.0 g，随机分为7组，每组5只，其中1组作为正常对照组，喂饲正常饲料，其余6组作为实验组，分别为0 ADI组、1/25 ADI、1/5 ADI、ADI、5 ADI、25 ADI组，喂饲缺铜饲料。每天上午固定时间灌胃给予不同剂量葡萄糖酸铜溶液，0ADI组灌去离子水。经测定特制缺铜饲料中含有微量的铜元素，含量为0.12 mg/kg，经换算，喂饲缺铜饲料的大鼠每天从饲料中摄入的铜为0.015 mg/kg。各实验组大鼠铜摄入量为灌胃给予葡萄糖酸铜中铜含量与缺铜饲料中铜含量之和，如表1所示。

实验大鼠饲养到90 d时经腹主动脉致死量采血5~8 ml。其中0.04 ml全血直接加入到MB5微量元素分析仪配套稀释液中，混匀，用于测定血中铜元素含量；非抗凝血5~8 ml置于非抗凝管中，充分静置后，2 500 r/min离心10 min，得淡黄色血清，用于测定铜蓝蛋白(ceruloplasmin ，CP)活力水平。致死量采血处死大鼠后，剖取肝脏用生理盐水清洗，用于测定肝脏中铜元素含量。

1.2.3　血液中铜元素含量测定  将0.04 ml全血加入到MB5微量元素分析仪配套稀释液中，混匀，上机直接检测，直接测得全血中铜元素含量(mg/L)。

1.2.4　血液中铜蓝蛋白含量测定　依照试剂盒说明书进行操作。

1.2.5　肝脏中铜元素含量测定  将0.5 g大鼠新鲜肝脏组织加入150 ml洁净的三角瓶内，每瓶加1 ml优级纯的高氯酸和10 ml优级纯的硝酸，浸泡过夜，在电热板上加热直至瓶内组织完全消化，整个瓶完全清洁，瓶底的固体物质完全变成灰白色，准确加入1%的盐酸15 ml，放置过夜，用原子吸收光谱仪测定其吸光度，并通过标准曲线分析，得到肝脏中铜含量(μg/g)。

1.3　统计学方法

数据用-x±s表示，采用SPSS 16.0中单因素方差分析进行总体差异显著性检验，采用LSD比较组间差异。用Regression中Curve Estimation，通过线性回归进行相关性分析，作回归曲线，得到回归方程。检验水准α=0.05，双侧检验。

2　结　果

本实验测定摄入不同剂量铜的大鼠血中铜含量、肝脏铜含量及CP活力，结果见表1。其中，ADI组与正常对照组的铜摄入量接近，但其摄入方式不同。ADI组的3个指标与正常对照组相比差异均无统计学意义(P 均 > 0.05)。铜摄入量低于日常摄入量(ADI组)，0ADI、1/25ADI组大鼠血中CP活力及肝脏铜含量均低于正常对照组，差异均具有统计学意义(P < 0.05)。1/5ADI组大鼠铜摄入量仅体现在血中CP活力水平低于正常对照组(P < 0.05)。0ADI组大鼠血铜含量低于正常对照组，差异有统计学意义(P < 0.05)。从1/25ADI 组起，尽管随着铜摄入量的增加，但各组血铜含量变化仍不明显，与正常对照组相比差异无统计学意义(P > 0.05)。铜摄入量高于日常摄入量时，5ADI、25ADI组大鼠肝铜含量均高于正常对照组，差异有统计学意义(P < 0.05)；此时大鼠血中CP活力水平也高于正常对照组，25ADI组与正常对照组相比差异有统计学意义(P < 0.05)。可见肝铜含量及血中CP活力均可敏感反映铜摄入量。

我们进一步分析了大鼠铜摄入量与肝铜含量及血中CP活力的关系。发现大鼠血中CP活力随着铜摄入量的增加而上升且幅度渐小，大鼠血中CP活力与铜摄入量之间呈对数正相关关系(R2 = 0.984 5，P < 0.05)，方程式为y=5.192 ln(x)+30.276，回归曲线见图1。而大鼠肝铜含量随着铜摄入量的增加呈现直线上升趋势(R2  = 0.989，P < 0.05)，线性回归方程为y = 0.776 x+2.261 5， 见图2。可见，大鼠血中CP活力水平及肝铜含量与大鼠铜摄入量均呈现良好的剂量依赖性关系，均可以敏感清晰的反映出不同剂量组大鼠铜摄入水平。

3　讨　论

铜是人们生产生活环境中存在的一种重要金属元素及人体内一种必需的微量元素，目前铜暴露水平可能产生的健康效应研究在国内外相关研究领域倍受重视，近年来国内研究人员从流行病学、基础研究、临床研究等不同角度对铜与健康的相关性进行多方面探讨[5-7]，因此，选择敏感的体内指标用以评价铜的摄入量是铜的相关健康效应研究中的一个重要环节。关于铜代谢的研究表明[8]，铜经口摄入后通过肠黏膜吸收入体内，经过门脉血液运至肝脏。铜的主要贮存部位是肝脏，肝脏摄入的大部分铜被渗入血浆铜蓝蛋白(CP)，释放入血中，然后被运送入组织。而铜动力学的隔室模型研究表明，铜经口摄入后，会从肝隔室流向一个血浆隔室，并由该血浆隔室流向其它组织隔室，铜吸收及内源性铜的排泄量与铜的摄入量并非线性关系，即血铜含量无法明确的反映出铜摄入水平，本研究结果也证明血铜含量不随铜摄入量的增加而发生明显变化。

吸收后的铜在血中与白蛋白和氨基酸结合，与肝脏生成的α-球蛋白牢固结合，形成CP。CP是一种含铜的蓝色蛋白，每个分子血清CP含有6~8个铜原子，正常人血清铜的95%存在于CP中。CP在体内主要负责铜的运输，并与铜在体内的稳定性密切相关[9]。本研究发现CP活力与铜摄入量呈现对数正相关，而随着铜摄入量的增加CP活力升高幅度渐缓可能是由于过多的Cu2+产生了空间位阻效应，干扰了CP发挥作用[10]。

本研究以食用常规饲料、正常饲养的大鼠作为正常对照组，6个实验组以0为起点，5倍剂量间距灌胃给予葡萄糖酸铜。其中0ADI组是仅摄取缺铜饲料灌胃剂量为0组大鼠，而ADI组为大鼠食用缺铜饲料同时灌胃葡萄糖酸铜时体内所达到的铜水平，与正常对照组铜的摄入方式有所不同。本实验如此设计剂量组可以保证灌胃剂量的连续性，将各实验组与食用常规饲料的正常对照组进行比较研究，判断大鼠摄入不同剂量铜对各研究指标所产生的影响。实验中选用血中铜含量，肝中铜含量及血中CP水平进行比较，肝铜含量与铜摄入量呈现线性正相关，由于肝是铜的主要贮存部位，肝铜含量能更敏感清晰的反映铜的摄入水平。但CP可通过血样直接测得，相对于测定肝铜含量来说，生物样本容易得到，检测方法简单，更适合应用于大量样本的检测。

参考文献

[1]　吴岚艳，蔡美琴.  铜代谢异常相关疾病研究[J]. 中国临床营养杂志，2006，14 (5)：328-332.

[2]　陈秉衡，郭红卫，施　玮，等. 过高和过低摄入必需微量元素的危险评价[J]. 中华预防医学杂志，2002，36 (6)：414-416.

[3]　苗　  青，刘庆勇，李　  军，等.人体铜的代谢[J]. 国外医学地理学分册，1999，20 (1)：16-21.

[4]　施新猷. 医用实验动物学[M].  陕西：陕西科学技术出版社，1989：448，525.

[5]　陈炜俊，蔡美琴，杨科峰，等.  铜及其他营养因素与缺铁性贫血的相关性研究[J]. 卫生研究，2009，10 (Sup)：12-15.

[6]　王　涛，殷建忠，杨科峰，等. 矿区成年居民膳食铜、铁和锌的摄入量调查及测定方法比较[J]. 上海交通大学学报(医学版)，2010，30 (11)：1412-1414.

[7]　段　链，程义斌，金银龙. 铜缺乏状态下铜摄入量及铜锌比值对大鼠脂质过氧化的影响[J]. 癌变·畸变·突变，2009，21 (6)：447-451.

[8]　王　婷，尚　慧，殷素雅，等. 矽肺患者血清铜蓝蛋白的活性与微量元素铜相关初控[J]. 工业卫生与职业病，2006，32 (4)：226-227.

[9]　褚　波. 铜蓝蛋白的分离纯化及其性质与功能基团研究[D]. 重庆：西南大学，2006：53-58.

[10] 尹朝霞，胡文泽，高　亢，等. 铜蓝蛋白与冠心病关系临床研究[J]. 医学研究杂志，2007，36 (3)：92.

收稿日期： 2010-12-07； 修订日期：2011-01-07

基金项目： 国际铜业协会(ICA)资助项目“铜摄入量对大鼠血脂影响”(H-  AS-07-02)

作者简介： 段　 链(1978-　 )，女，吉林省白山市人，助理研究员，医学博士，研究方向：环境卫生学。

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