郑海霞1/周清华2/申东兰3/彭   安3/何艳玲3/曹菊秀1

(1. 北京大学深圳医院体检科，广东   深圳518000； 2. 天津医科大学总医院肺外科，天津300052； 3. 北京大学深圳医院肿瘤内科，广东深圳   518000)

Validation of nm23-H1  gene transfection in lung cancer cells

ZHENG Hai-xia1，ZHOU Qin-hua2， SHEN Dong-lan3， PENG An3， HE Yan-lin3， CAO Ju-xiu1

(1. Department of Health Examination, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518000; 2. General Hospital of Tianjin Medical University , Tianjin 300052; 3. Department of Oncology,  Peking  University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518000, Guangdong, China)

【摘要】 目的：  通过稳定、高效、低毒的基因转染方法将nm23-H1基因导入该基因缺失的人肺大细胞癌株L9981，从基因及蛋白水平鉴定nm23-H1基因转染肺癌细胞的建立。 方法： 以JM109为宿主菌，转化质粒载体PCMV-neo-Bam- nm23-H1，制备nm23-H1 基因的真核表达载体；利用阳离子脂质体Lipofectamine介导，将nm23-H1基因导入L9981细胞株。采用RT-PCR技术检测转染后nm23-H1基因的表达，并用Western blot技术检测转染后nm23-H1蛋白的表达。 结果: 转染后的L9981细胞株中可检测到nm23-H1 mRNA及nm23-H1蛋白的阳性表达。 结论:  建立表达nm23-H1基因的肺癌细胞株L9981，为研究nm23-H1对肺癌恶性转移表型的逆转作用作基础准备。

【关键词】 nm23-H1; 基因转染; 肺癌细胞; 肿瘤转移

   中图分类号： R730.231     文献标识码： A     文章编号： 1004-616X(2011)02-0145-03     doi: 10.3969/j.issn.1004-616x.2011.02.015

【ABSTRACT】 OBJECTIVE: nm23-H1 gene was transfected into nm23-H1 deletion human large lung cancer cell L9981 by stable，continuous and high effective gene transfection  method. METHODS: nm23-H1 gene  expression carrier was established, nm23-H1 was transfected in L9981 cell line and the expression of nm23-H1 was confirmed by gene transduction and protein translation. RESULTS: Transfected cell line showed nm23-H1 gene and protein expressions. CONCLUSION: The expression of nm23-H1 by L9981 cell line provides support for utilizing nm23-H1 as a potential therapy in lung cancer.

【KEY  WORDS】 nm23-H1；gene trasfection； lung cancer； tumor metastasis

原发性支气管肺癌(简称肺癌)是最常见的恶性肿瘤之一，发病率在很多国家都有明显增高趋势。随着分子生物学研究的进展，发现肺癌的发生与原癌基因的活化、抑癌基因的丢失密切相关。

近年来细胞水平和组织水平的研究表明nm23-H1为肿瘤转移抑制基因，与癌细胞的转移潜力密切相关。我们利用基因转染技术，通过体外实验将nm23-H1基因转染到该基因缺失细胞株L9981中，初步探讨nm23-H1基因对肺癌的治疗价值，以期为肺癌的基因治疗提供客观依据。

1  材料与方法

1.1  主要材料

nm23-H1基因真核表达质粒载体PCMV-neo-Bam- nm23-H1由美国国立癌症研究所的Patricia S.Steeg教授惠赠；nm23-H1基因缺失人肺大细胞癌细胞株L9981由四川省重点实验室四川大学华西医院肺癌分子实验室建立；限制性内切酶Bam-H1、T4DNA连接酶、小牛血清、G418、PVDF膜、Lipofectamine、Trizol和RT-PCR试剂盒等分别购自Invitrogen、Gene、Takara、华美等公司; 抗nm23-H1兔多克隆抗体为Santa Cruz产品，生物素耦联的蛋白质Marker和发光试剂盒LumiGLO购至Technology公司；

1.2  nm23-H1稳定转染细胞的鉴定

1.2.1  载体制备  以JM109为宿主菌，转化质粒载体PCMV-neo-Bam- nm23-H1后，抽提质粒，用限制性内切酶Bam-H1酶切鉴定；同时酶切后用T4DNA连接酶连接，构建空载体PCMV-neo-Bam。

1.2.2  细胞转染   L9981系人肺大细胞癌细胞株，采用RPMI-1640培养液+10％小牛血清于37 ℃、5％CO2孵箱培养，选生长良好的细胞，用脂质体Lipofectamine 分别将基因载体PCMV-neo-Bam- nm23-H1和空载体PCMV-neo-Bam转染入L9981细胞内，同时设L9981＋脂质体对照组，用G418筛选，浓度为400 μg/ml，维持3周以上，至对照组细胞全部死亡，转基因组和空载体组细胞继续传代培养。

1.2.3  RT-PCR检测  nm23-H1引物序列：５'-AACC ATGGCCAACTGTGAGC-3' (上游)；５'-TCATTCATAGA TCCAGTTCTG-３' ( 下游)，扩增产物长度为462 bp。用Trizol提取细胞总mRNA，取2 μg mRNA为模板，按RT-PCR试剂盒加样，反应条件：逆转录50 ℃  30 min，解链94 ℃  30 s，退火57 ℃  30 s ，延伸72 ℃  45 s.

1.2.4  Western blot杂交  选生长良好的细胞克隆，提取细胞蛋白，在10％ SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，上样量为20 μg总蛋白 (蛋白定量采用考马斯亮蓝G-250染料法)。电泳完毕后，电转移至PVDF膜。滴加nm23-H1抗体 (1∶2 000) 4 ℃杂交过夜，二抗(羊抗兔HRP偶联，1∶1 000) 和抗生物素抗体(１∶2000)杂交1 h，加发光试剂盒LumiGLO，用底片曝光，检测nm23-H1表达。

2   结   果

2.1   质粒转化及酶切图谱鉴定的结果

含重组质粒的JM109在有AMP的琼脂平板上生长良好。酶切结果见图１，目的基因片段长度为732 bp，质粒片段长度为6 550 bp。

2.2   质粒转染L9981肺癌细胞及阳性克隆的筛选 

基因转染72 h后，将肺癌细胞以1∶10传代于G418培养基，3周后对照组L9981肺癌细胞株细胞全部死亡，稳定转染nm23-H1基因的人高转移大细胞肺癌细胞株L9981/nm23-H1和稳定转染了空载体质粒的人高转移大细胞肺癌细胞株L9981/PCMV出现阳性克隆，5周后细胞长满，相差显微镜下可见L9981/nm23-H1细胞呈单层生长，排列规则，细胞大小较均一，而L9981/PCMV和L9981细胞呈交叉重叠生长，排列紊乱，细胞大小不均，形态不规则(图2)。

2.3   nm23-H1 mRNA表达

转染后的L9981/nm23-H1细胞株nm23-H1 mRNA 表达阳性，而空载体组L9981/PCMV和L9981细胞株阴性，见图3。

2.4  nm23-H1蛋白表达  转染后的L9981/ nm23-H1细胞株nm23-H1 蛋白表达阳性，而空载体组L9981/ PCMV 和L9981细胞株呈阴性，见图4。

3   讨   论

nm23基因是首先由美国国立癌症研究所的Steeg 等[1]应用消减杂交(substractive hybridization)技术，从7个转移潜能不同的鼠黑色素瘤细胞系K-1735的cDNA文库中筛选出的一个cDNA克隆。体外实验发现nm23-H1基因(non-metastasis 23 clone，编号为23的cDNA克隆)在低转移鼠黑色素瘤细胞系的表达强度是高转移鼠黑色素瘤细胞系的10倍，表明nm23在高转移肿瘤中表达降低，故认为nm23基因是一种肿瘤转移抑制基因。随后Rosengard[2]用Steeg分离的鼠nm23 cDNA 在人纤维母细胞cDNA文库中筛选出第1个人类nm23基因命名为nm23-H1。自从nm23-H1被克隆并发表后，大量的研究工作集中于体外细胞系的基因转染、基因产物比较分析、染色体定位等。迄今为止，人类nm23 基因已报道了8个亚型，即nm23-H1至nm23-H8[2-4]，其中nm23-H1基因与肿瘤转移关系最密切，已得到人们的普遍重视。

nm23-H1基因定位于人类染色体17q21.3[4]，长度约10 kb，串联排列，中间隔有3～4 kb。nm23-H1基因由5个外显子和4个内含子组成，编码区由533个核苷酸组成，产物为152个氨基酸组成的分子量为17 kD的核内及胞浆蛋白，与二磷酸核苷激酶(nucleotide diphosphate kinase, NDPK) 的氨基酸序列具有高度同源性。nm23-H1基因的表达水平与肿瘤的侵袭和转移能力之间存在密切的关系。许多恶性肿瘤包括肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌和大肠癌等中均发现nm23-H1基因表达降低与肿瘤转移密切相关。

在以往的实验中，发现nm23-H1基因缺失大细胞癌细胞株L9981的恶性转移表型发生了明显改变，包括黏附、浸润、侵袭、转移能力增强。为了进一步了解nm23-H1基因在此过程中发挥的作用，我们利用基因转染技术，将此基因转导入肺癌细胞，为进一步在分子水平上诊断及治疗肺癌打下坚实的基础。

本实验用基因转染技术成功的建立了含nm23-H1基因的肺癌细胞株L9981/ nm23-H1，为进一步的研究提供了基础。

参考文献

[1]  Steeg PS, Bevilacqua G, Kopper, et al. Evidence for a novel gene associated with low tumor metastatic potential[J]. J Natl Cancer Inst, 1988，80 (3)：200-206

[2]  Rosengard AM, Krutzsch HR. Nm23/Awd protein in tumour metastasis and aberrant Drosophila development[J]. Nature,  1989，342 (6246)：177-180.

[3]  Stahl JA, Leone A, Rosengard AM, et al. Identification of a second human nm23 gene, nm23-H2[J]. Cancer Res, 1991，51 (1)： 445-449.

[4] Backer JM, Mendola CE, Kovesdi I, et al. Chromosomal localization and nucleoside diphosphate kinase activity of human metastasis-suppressor genes NM23-1 and NM23-2[J]. Oncogene， 1993，8 (2)：497-502.

收稿日期： 2010-10-29；修订日期：2010-11-01

基金项目： 国家自然科学基金资助项目(30070333)

作者简介： 郑海霞(1974-  )，女，山东人，主治医师，医学博士，研究方向：肺癌的分子诊断及治疗。

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