周　飞/常　艳

(国家上海新药安全评价研究中心，上海 201203)

Assessment of developmental neurotoxicity with PC12 cells using high throughput screening

ZHOU Fei, CHANG Yan

(National Shanghai Center for New Drug Safety Evaluation and Research, Shanghai 201203, China)

　　【摘要】 目的： 探讨PC12细胞结合高通量筛选系统评价发育神经毒性的有效性，建立以PC12细胞结合高通量系统的经济、快速、高效的发育神经毒性高通量初筛方法。应用高通量初筛方法对已知的发育神经毒性阳性物质和阴性物质进行验证分析。方法：应用Cellomics ArrayScan高通量筛选系统定量检测13种物质对PC12细胞神经突起生长以及细胞活力的影响。 结果： K252a、地塞米松、苯并芘、U0126可抑制神经突起生长；毒死蜱、乙酸铅、丙戊酸、邻苯二甲酸二甲酯可促进神经突起生长。对乙酰氨基酚、糖精、山梨醇、阿莫西林等物质对PC12细胞神经突起均无显著影响。 结论： 通过上述物质的验证表明，这一筛选方法检测神经发育毒性切实有效，并达到经济、快速、高效的发育神经毒性高通量初筛方法的要求，可为进一步的发育神经毒性评价提供参考。

　　【关键词】 高通量； 发育神经毒性； PC12细胞； 神经突起

　　中图分类号： R730.45　　　　文献标识码： A　　　　文章编号： 1004－616X(2010)06－0409－09

　　【ABSTRACT】 OBJECTIVE: Assessment of developmental neurotoxicity plays an important role in the protection of a child's health. In response to the need for more efficient methods to identify chemicals that pose a hazard to the developing nervous system, the present study evaluated the utility of an automated high throughput screening system to detect chemical effects on neurite outgrowth in PC12 cells. METHODS: Plating 2500 cells per well with 250 ng/mL nerve growth factor for 96 h in a 96_well format to assess neurite outgrowth. RESULTS: The present study assessed 8 chemicals that had been previously shown to affect neurite outgrowth in PC12 cells. 2 chemicals (Benzopyrene, U0126) were found to inhibit neurite outgrowth with the concentration that could decrease cell viability. K252a and dexamethasone were found to inhibit neurite outgrowth without any effect on cell viability. Lead acetate and chlorpyrifos were found to increase neurite outgrowth in cytotoxic concentration and valproic acid increased neurite outgrowth in non_cytotoxic concentration. Phenytoin had no effect on neurite outgrowth. Developmental neurotoxicity of another 5 chemicals that have not been reported were also assessed with this system. Amoxicillin, paracetamol, sorbitol and saccharin sodium had no effect on neurite outgrowth but dimethyl phthalate could increase neurite outgrowth in cytotoxic concentration. CONCLUSION: These results demonstrated that a high thrughput screening system could rapidly monitor chemical effects on neurite outgrowth in vitro. Concentration_response data for both neurite outgrowth and cell viability allowed for determination of specificity of chemical effects on a neurodevelopmental endpoint.

　　【KEY WORDS】 high throughput screening; developmental neurotoxicity; neurite outgrowth

　　发育神经毒性(developmental neurotoxicity, DNT)指个体在发育过程中暴露于某些神经毒性物质后引起的神经系统结构和功能的异常改变，这种改变可以发生在整个生命周期的任何阶段。目前发育神经毒性评价指导原则主要有美国环保署(United States environmental protection agency, US.EPA)的870.6300实验指导原则和经济合作和发展组织(organisation for economic co_operation and development, OECD)的TG426发育神经毒性实验指导原则。官方指导原则推荐试验方法主要以啮齿动物体内试验为主，首选大鼠。目前官方推荐的试验方法存在费时、费力、不经济、某些评价终点敏感性差、无法对大量化学物质进行快速评价的缺点，因此，目前很多研究集中在DNT的初筛方法建立上。本研究选取PC12细胞结合高通量筛选系统进行了DNT初筛方法的建立, PC12细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株，具神经内分泌细胞的一般特征，未分化的PC12细胞在神经生长因子(neurite growth factor, NGF)作用下可以长出神经突起，是模拟体内神经突起生长的经典模型，因其具可传代的特点，广泛应用于神经生理和神经药理学研究。

1　材料与方法

1.1　试剂及耗材

　　DMEM/F12培养基，胎牛血清，马血清均购自Gibco公司；细胞培养瓶，细胞培养皿，15 ml移液管，96孔板购自Corning公司；神经突起生长染色试剂盒(neurite outgrowth hit kit)购自Thermo Fisher公司；无水乙醇(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司；胶原Ⅰ和神经生长因子(7S)购自Sigma公司。

1.2　受试物

　　受试物依据文献报道进行选择，分别为U0126、K252a、乙酸铅、丙戊酸、苯妥英钠、地塞米松、毒死蜱、苯并芘、邻苯二甲酸二甲酯、糖精、山梨醇、对乙酰氨基酚、阿莫西林，共13种物质。上述13种物质均在生活中应用比较广泛、毒性作用各异。除U0126购自碧云天试剂公司外其余均购自Sigma。丙戊酸、糖精、山梨醇溶剂为水，其余溶剂均为无水乙醇(分析纯)。

1.3　试验方法

1.3.1　细胞培养　未分化PC12细胞(购自中科院上海生命科学研究院细胞库)接种于含10％马血清和2.5％胎牛血清的DMEM/F12培养基，37 ℃加湿培养。正式试验使用5代(从接收细胞算起)以内的细胞，以避免由于传代引起的PC12细胞显型差异对实验结果造成影响。试验所使用的96孔板使用胶原Ⅰ包被。细胞接种密度以每孔2 500个(25 000/ml)为宜，每孔100 μl培养液，NGF和细胞同时加入。

1.3.2　受试物处理　细胞接种2 h后(保证细胞充分贴壁)每孔加入1 μl的受试物溶液。受试物浓度选择依据相关文献报道或者临床可能接触到的水平，同时产生明显的细胞毒性，从最高浓度开始依次对半稀释11个浓度。

1.3.3　PC12细胞的染色和分析　处理96 h后，细胞即按照荧光染色试剂盒的方案进行操作。通过预实验确定好相关分析参数。每个受试浓度分析两个孔，每孔分析500个细胞，由于细胞毒性的存在，个别孔细胞数目过少或者个别孔细胞未能通过设定参数，此类孔被Cellomics ArrayScan高内涵筛选系统识别为无效孔，不进入统计分析。

1.4　统计学方法

　　本研究试验中神经突起长度和每视野细胞数及细胞存活率(细胞存活率=给药组每视野细胞数/对照组每视野细胞数)数据采用Cellomics Neuronal Profiling BioApplication分析软件(V3 version，Thermo Fisher公司)进行分析；数据的处理采用SPSS13.0软件。边缘效应中边缘组和内部组间指标差异采用独立样本t检验；溶剂效应影响、最适神经生长因子浓度选择、各受试物对细胞神经突起生长影响的统计分析均采用单因素方差分析。

2　结　果

2.1　试验方法的建立

2.1.1　边缘效应以及溶剂浓度对PC12细胞活力和神经突起生长的影响　为了验证蒸发量差异是否会对神经突起生长产生影响，作者对边缘孔细胞和内部孔细胞进行对比研究。表1数据显示，边缘孔和内部孔相比，神经突起平均长度、神经突起总长度和细胞存活率间的差异均无统计学意义(P>0.05)，这说明细胞培养96 h后边缘效应并不会对实验结果造成显著影响。

　　为了验证溶剂对PC12细胞的影响，作者分别加入不同体积的无水乙醇进行了试验，结果如表2显示：每孔加入1 μl的无水乙醇并不会对PC12细胞造成明显影响。

2.1.2　最适NGF的浓度和时间选择　为了确定能够诱导PC12细胞神经突起生长的最适NGF浓度，作者采用了7个不同浓度NGF进行了分析，结果显示(图1)，NGF在10～200 ng/ml之间，即可明显诱导PC12细胞神经突起的生长，随NGF浓度增加而增长；但是当浓度达到200 ng/ml后，NGF诱导效能不再随着浓度的增加而增强。本实验采用250 ng/ml浓度的NGF作为诱导PC12细胞神经突起生长的试验浓度。在该NGF浓度下，2 h后即可见到神经突起长出，神经突起的生长会持续4～7 d，我们选取第3天进行检测，此时神经突起生长相对比较旺盛，同时细胞间还没有形成交联，不会对分析造成影响(图2)。

2.1.3　神经突起生长抑制剂对PC12细胞神经突起生长的影响　为了检验高通量系统对PC12细胞神经突起检测效力，选取了两种已知的神经突起抑制剂进行了验证分析。结果见表3和图3，与溶剂对照组相比，K252a从0.244到250 ng/ml的浓度范围内均能明显抑制神经突起的生长。U0126在0.02 ～2.5 μg/ml的给药浓度间和溶剂对照相比，尽管没有显著降低神经突起的长度，但是具有降低神经突起长度的趋势。该作用在5～20 μg/ml较高细胞毒性的给药浓度范围和阴性对照组相比差异显著(P<0.05)。

2.2　发育神经毒性阳性物质对PC12细胞神经突起生长的影响

2.2.1　乙酸铅　乙酸铅在0.057～3.625 μg/ml浓度范围对神经突起生长和细胞存活的影响并不明显，但当浓度达到7.25、14.5、29 μg/ml时就有促进神经突起生长的趋势，在58 μg/ml时，乙酸铅可以显著促进神经突起生长(P<0.05)。

2.2.2　地塞米松　地塞米松在0.342～87.500 μg/ml的浓度均可明显抑制神经突起的生长，在21.875、43.750、87.500 μg/ml浓度时可以引起明显的细胞毒性(P<0.05)。

2.2.3　丙戊酸与苯妥英钠　丙戊酸在36.719 μg/ml起神经突起长度逐渐增强，在73.438、146.875和293.750 μg/ml的浓度范围丙戊酸较对照组显著促进神经突起的生长(P<0.05)。从6 μg/ml浓度开始，苯妥英钠有抑制神经突起生长的趋势。

2.2.4　毒死蜱　毒死蜱在0.038～9.750 μg/ml浓度范围对神经突起生长无显著影响，该浓度范围并未对细胞活力造成显著影响。但在19.5 和39 μg/ml浓度下，和对照组相比，毒死蜱可显著促进神经突起的生长，该浓度范围也引起了明显的细胞毒性(P<0.05)。

2.2.5　苯并芘　苯并芘在0.006～3.000 μg/ml浓度范围对神经突起生长无显著影响，在6 μg/ml的浓度，苯并芘抑制神经突起生长的效能和阴性对照组相比，差异显著(P<0.05)。在1.500、3.000和6.000 μg/ml剂量时可显著抑制细胞活力(P<0.05)。

2.3　阴性物质对PC12细胞神经突起发育的影响

2.3.1　邻苯二甲酸二甲酯　从我们的实验数据分析得出，邻苯二甲酸二甲酯(dimethyl phthalate，DMP)在接近细胞毒性浓度的剂量可显著促进神经突起的生长，可能为具有潜在神经发育毒性的物质。其促进神经突起生长的机制还需进一步研究。

2.3.2　糖精　糖精各浓度均对神经突起生长无显著影响，在14.250～114.000 μg/ml的给药剂量显著降低了细胞存活率(P<0.05)。

2.3.3　山梨醇、对乙酰氨基酚、阿莫西林　从我们的实验数据分析得出，不同浓度的这3种物质并不能对神经突起长度产生明显影响，但在较高的浓度时其细胞存活率较阴性对照组显著降低(P<0.05)。

3　讨　论

　　这项研究主要利用高通量筛选系统，以PC12细胞神经突起生长状况为检测指标，评价该方法在检测神经发育毒性物质方面的有效性。从本研究的实验数据分析可以得出，PC12细胞在NGF的诱导下，可以长出神经突起，该反应呈时间和浓度依赖性。

　　为了验证PC12细胞神经突起作为高通量筛选系统检测指标是否有效，选取了两种已知的神经突起抑制剂进行了验证分析。这两种药物分别为MAPK激酶抑制剂K252a[1－2]和酪氨酸激酶抑制剂U0126[3－4]，K252a可以抑制NGF激活的信号转导通路中MAPK激酶的活化，U0126可以抑制NGF激活的信号转导通路中ERK激酶活化进而抑制神经突起的生长。这两种激酶均是NGF诱导PC12细胞神经突起生长的关键性激酶。

　　有研究[6]证实，铅可以调控转录因子SP1与DNA的结合，SP1在NGF诱导的神经突起发育过程中具有重要作用。将未分化的PC12细胞暴露于NGF后，在48 h内SP1转录因子与DNA结合能力显著增加。将PC12细胞单独暴露于0.1 μmol/L铅，也可引起相似反应。铅可以显著促进PC12细胞神经突起的生长，在NGF诱导的PC12细胞中，这种作用尤为明显。本研究的实验数据也充分显示了铅的这一作用。

　　类固醇类药物[7]可以影响未成熟脑的发育，最近关于类固醇类药物对中枢神经系统的副作用影响的报告引起了人们对此类药物安全性的关注。Brown等[8]的研究证实，地塞米松可以强烈抑制NGF诱导的PC12细胞神经突起发育。本研究结果显示，从0.342 μg/ml的给药剂量开始，地塞米松即可显著降低PC12细胞神经突起的长度。

　　文献[9]报道，很多抗癫痫药具有很强的致畸作用，对胎儿的神经系统损伤尤为显著，可引起小头症、发育迟缓、智力低下等缺陷，是具有明显发育毒性和神经毒性的药物。

　　丙戊酸[10－11]主要通过激活ERK/MAPK信号转导途径从而可以促进PC12细胞的神经突起生长，本课题的实验数据显示，丙戊酸在73.438 μg/ml的给药剂量及以下剂量可显著促进神经突起的生长，但在该剂量范围也产生了明显的细胞毒性。到目前为止，还没有相关文献关于苯妥英钠对PC12细胞神经突起生长影响的报告，本研究数据显示，苯妥英钠从6 μg/ml给药剂量开始，可抑制神经突起生长，尽管和对照组相比没有明显差异。至于其对神经突起是否会产生影响还需进一步研究。

　　众多研究[12－13]证实，毒死蜱(chlorpyrifos，CP)是具有明显发育神经毒性的物质，毒死蜱神经发育毒性作用机制[14]可能和胆碱酯酶的抑制作用有关，在毒死蜱对PC12细胞神经突起生长状况的研究中，Das等[14]研究证实，毒死蜱和其代谢物均能抑制神经生长因子诱导的神经突起生长，然而Theodore等[15]的研究则发现，毒死蜱可以促进神经生长因子诱导的神经突起生长。从数据可以看出，在非细胞毒性给药剂量下，毒死蜱对PC12细胞神经突起并没有显著影响，在细胞毒性剂量下可以显著增加神经突起的长度。我们的试验结果和Theodore的实验结果一致。

　　人们对多环芳烃类化学物质的关注往往集中在其致癌性方面，然而有文献报道[16]，未成年人暴露于多环芳烃类物质后会引起神经系统发育障碍。Theodore等[15]的研究发现，苯并芘(Benzo[a]pyrene，B[α]P)可以抑制PC12细胞分化和神经突起生长，降低酪氨酸羟化酶和胆碱乙酰基转移酶的活性。从实验数据可以看出，苯并芘在细胞毒性的剂量可以明显抑制神经突起的生长。

　　文献[18]报道，多环芳烃类物质具有生殖发育毒性，可干扰生精细胞的功能，主要通过影响内分泌系统发挥作用。目前尚无关于其神经发育毒性以及对PC12细胞神经突起发育影响的文献报道。从我们的实验数据分析得出，邻苯二甲酸二甲酯在接近细胞毒性浓度的剂量可显著促进神经突起的生长，可能为具有潜在神经发育毒性的物质。其促进神经突起生长的机制还需进一步研究。

　　有研究[19－20]证实，糖精能够抑制NGF诱导的神经突起的生长。但是从我们的研究资料推断，糖精钠并不能抑制NGF诱导的神经突起生长，各剂量组和对照组相比并没有明显差异，产生这种现象的原因可能是我们所使用的受试物浓度并没有达到抑制神经突起生长所需浓度(10 mmol/l)，另一方面，由于糖精钠抑制神经突起生长主要通过降低生长因子和受体的亲和力来完成，这种抑制是可逆性的，所以随着孵育时间的延长，其亲和力可能会恢复。

　　山梨醇、对乙酰氨基酚、阿莫西林这3种物质均是生活中应用比较广泛的药品或食品添加剂，其毒理学数据研究比较充分，目前为止还没有文献认为这3种物质具有神经发育毒性。从我们的实验数据分析得出，不同的给药剂量并不能对神经突起长度和细胞活力产生明显影响。

　　本研究选取的6种有文献报道的神经发育毒性物质(毒死蜱、苯并芘、丙戊酸、苯妥英钠、乙酸铅、地塞米松)和5种尚无相关文献报道具有神经发育毒性的物质(邻苯二甲酸二甲酯、山梨醇、对乙酰氨基酚、阿莫西林、糖精)，在选取的11种物质中，有6种物质(丙戊酸、毒死蜱、苯并芘、地塞米松、乙酸铅、邻苯二甲酸二甲酯)被检测出了强阳性结果(P<0.05)，苯妥英钠为弱阳性结果，在6 μg/ml的给药浓度下有降低神经突起生长的趋势。4种物质(阿莫西林、对乙酰氨基酚、山梨醇、糖精钠)为阴性结果。实验结果和文献报道结果基本一致。有文献报道的可以对PC12细胞产生直接作用的物质中，大部分被检测为阳性结果，这说明该方法检测具有影响神经突起生长作用的物质是十分有效的。但是，有些文献报道具有抑制神经突起作用物质(糖精)在该系统中并未成功识别，而有些尚无文献报道对PC12细胞神经突起有作用的物质(邻苯二甲酸二甲酯)在该系统中出现阳性检测结果。这说明，该系统可能会出现假阳性结果。综合考虑该系统所检测的所有物质的结果，可以认为，发育神经毒性高通量检测方法具有较好的预测发育神经毒性价值，特别是对直接作用于神经突起生长的物质，可以为发育神经毒性体内评价提供可靠的参考数据。

　　评价一个体外筛选方法的好坏一般从以下4个方面来考虑，①敏感性：阳性物质(文献报道)在高通量筛选系统中被检测出的百分比。②特异性：非发育神经毒性物质在高通量筛选系统检测为阴性的百分比。③阳性预测率：高通量筛选系统检测出的阳性物质确实为真正发育神经毒性物质的百分比。④阴性预测率：高通量筛选系统检测出的阴性物质确实为非神经发育毒性物质的百分比。

　　本研究选取了2种(U0126，K252a)已知的对PC12细胞神经突起生长有明显抑制作用的物质验证PC12细胞神经突起作为高通量筛选系统筛选指标的有效性；另外选取了6种已知的神经发育毒性物质(毒死蜱、苯并芘、丙戊酸、苯妥英钠、乙酸铅、地塞米松)以及5种目前为止没有神经发育毒性报道的阴性物质(对乙酰氨基酚、糖精、山梨醇、邻苯二甲酸二甲酯、阿莫西林)，上述11种物质均在生活中应用比较广泛、毒性作用各异。

　　在本研究的结果中，高通量筛选系统的敏感性为87.5％(苯妥英钠由于未出现强阳性，所以不进入阳性统计，K252a和U0126也可认为是神经发育毒性物质)；特异性为80％；阳性预测率为87.5％(邻苯二甲酸二甲酯为假阳性物质)；阴性预测率为80％。整体来讲，该方法评价神经发育毒性是比较有效的。由于所选取的物质数量还比较有限，现在无法对该方法检测效能作最终评价，还需要作进一步的多中心大规模验证。

　　整个实验耗时4 d，每个试剂盒可检测约20种物质，每种物质平均花费不到300元。由此可见，高通量筛选方法可以对化学物质进行快速、可靠的优化筛选，与官方指导原则所推荐的评价方法相比，可降低所需要花费的物力和财力。

　　神经系统的发育是一个漫长而复杂的过程，神经突起的生长仅仅是神经系统发育阶段的一个重要部分。从本研究的结果来看，采用PC12细胞的发育神经毒性高通量初筛方法在预测化学物质的发育神经毒性，及化学物质的优化筛选方面有较好的应用价值。但是，利用PC12细胞神经突起作为发育神经毒性评价的指标也有局限性。NGF诱导的神经突起的生长既不是轴突也不是树突，同时也不能形成功能性突触，和体内神经突起的生长模式有较大差异。因此，PC12细胞仅适于评价和NGF诱导神经突起生长相关的终点或者神经突起生长一般机制(膜形成、细胞骨架装配等)，用PC12细胞模型评价轴突或树突效应是不适当的。很多神经发育毒性物质可能会对神经突起生长以外的其他指标产生影响，这类物质在PC12细胞结合高通量筛选方法的检测中很可能被漏检。因此，有必要建立几种以其他终点为检测指标的筛选方法，与现存的方法结合使用，可大大提高检测效力。总体来讲，由于神经系统发育的复杂性，单一的检测模型不可能完全预测物质的发育神经毒性，这就需要原代细胞模型和传代细胞模型，细胞水平模型和系统水平模型综合应用来提高检测效率，更好的为发育神经毒性的体内检测提供可信的参考数据。这也应该是发育神经毒性初筛方法的发展方向。

参考文献

[1] Koizumi S, Contreras ML, Matsuda Y, et al. K_252a: a specific inhibitor of the action of nerve growth factor on PC12 cells[J]. J Neurosci, 1998, 8(2):715－721.

[2] Hashimoto S. K_252a, a potent protein kinase inhibitor, blocks nerve growth factor_induced neurite outgrowth and changes in the phosphorylation of proteins in PC12 cells[J]. J cell boil, 1988, 107(4):1531－1539.

[3] Yutaro O, Arata Y, Shin T, et al. ERK5 activity is required for nerve growth factor_induced neurite outgrowth and stabilization of tyrosine hydroxylase in PC12 cells[J]. J Biol Chem,2009, 284(35):23564－23573.

[4] Das KP, Freudenrich TM, Mundy WR. Assessment of PC12 cell differentiation and neurite growth: a comparison of morphological and neurochemical measures[J]. Neurotoxicol Teratol, 2004, 26(3)：397－406.

[5] Lidsky TI, Schneider JS. Adverse effects of childhood lead poisoning: the clinical neuropsychological perspective[J]. Environ Res,2006, 100(2):284－293.

[6] Crumpton T, Atkins DS, Zawia NH, et al. Lead exposure in pheochromocytoma (PC12) cells alters neural differentiation and Sp1 DNA_binding[J]. Neurotoxicology, 2001, 22(1):49－62.

[7] Baud O. Postnatal steroid treatment and brain development[J]. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed,2004, 89(2):96－100.

[8] Brown JW, Fishman LM, Carballeira A. Studies of the neuronal transdifferentiation process in cultured human pheochromocytoma cells: effects of steroids with differing functional groups on catecholamine content and cell morphology[J]. Steroids, 1998, 63(11):587－594.

[9] Costa LG, Aschner M, Vitalone A, et al. Developmental neuropathology of environmental agents[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol,2004,44(1):87－110.

[10] Hao Y, Creson R, Zhang L, et al. Mood stabilizer valproate promotes ERK pathway_dependent cortical neuronal growth and neurogenesis[J]. J Neurosci, 2004, 24(29): 6590－6599.

[11] Van Bergeijk J, Haastert K, Grothe C, et al. Valproic acid promotes neurite outgrowth in PC12 cells independent from regulation of the survival of motoneuron protein[J]. Chem Biol Drug Des, 2006, 67(3):244－247.

[12] Bjorling_Poulsen M, Andersen HR, Grandjean P. Potential developmental neurotoxicity of pesticides used in Europe[J]. Environ Health, 2008,7(1):50.

[13] Slotkin TA, Seidler FJ. Oxidative and excitatory mechanisms of developmental neurotoxicity: transcriptional profiles for chlorpyrifos, diazinon, dieldrin, and divalent nickel in PC12 cells[J]. Environ Health Perspect, 2009, 117(4):587－596.

[14] Das KP, Barone SJr. Neuronal differentiation in PC12 cells is inhibited by chlorpyrifos and its metabolites: is acetylcho_ linesterase inhibition the site of action?[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 1999, 160(3):217－230.

[15] Slotkin TA, Seidler FJ. Benzo[a]pyrene impairs neurodifferen_ tiation in PC12 cells[J]. Brain Res Bull, 2009, 80(1/2):17－21.

[16] Perera FP, Rauh V, Whyatt RM, et al. Effect of prenatal exposure to airborne polycyclic aromatic hydrocarbons on neurodevelopment in the first 3 years of life among inner_city children[J]. Environ Health Perspect, 2006, 114(8): 1287－1292.

[17] Liu K, Lehmann KP, Sar M, et al. Gene expression profiling following in utero exposure to phthalate esters reveals new gene targets in the etiology of testicular dysgenesis[J]. Biol Reprod,2005, 73(1):180－192.

[18] Ishii DN. Effect of the suspected tumor promoters saccharin, cyclamate, and phenol on nerve growth factor binding and response in cultured embryonic chick ganglia[J]. Cancer Res, 1982, 42(2):429－432.

[19] Ishii DN. Inhibition of iodinated nerve growth factor binding by the suspected tumor promoters saccharin and cyclamate[J]. J Natl Cancer Inst, 1982, 68(2):299－303.

[20] Gartlona J, Kinsnera A,Bal_Pricea A . Evaluation of a proposed in vitro test strategy using neuronal and non_neuronal cell systems for detecting neurotoxicity[J]. Toxicol in Vitro, 2006, 20(9):1569－1581.

收稿日期： 2010－05－26； 修订日期： 2010－07－28

基金项目： “重大新药创制”科技重大专项(2008ZX09305－006)

作者简介： 周　飞(1984－　)，男，山东济宁人，硕士研究生，研究方向：神经发育毒性。

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