刘　辉1/刘　冉1/苏耀耀1/杨　淼1/浦跃朴1/尹立红1,/王　仪2/潘恩春2/郭　伟3/尤振兵3

(1.东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，南京 210009；2. 江苏省淮安市疾病预防控制中心，淮安 223001；3. 江苏省淮安市第一人民医院，淮安 223000)

A pilot study of differentially expressed microRNAs between esophageal squamous cell carcinoma and adjacent tissues in Huai'an population

LIU Hui1, LIU Ran1, SU Yao_yao1,YANG Miao1,PU Yue_pu1,YIN Li_hong1,,WANG Yi2,PAN En_chun2,GUO Wei3,YOU Zhen_bin3

(1. Key Laboratory of Environmental Medical Engineering, Ministry of Education, School of Public Health, Southeast University, Nanjing 210009; 2. Huai'an Center for Disease Control and Prevention, Huai'an 223001; 3. Huai'an First People's Hospital, Huai'an 223000,Jiangsu, China)

　　【摘要】 目的： 初步筛选淮安食管鳞癌与癌旁组织中差异表达的microRNAs，为进一步研究与肿瘤相关的microRNA在食管鳞癌发病机制中的作用奠定基础。 方法： 选取3例食管鳞癌病人癌组织及其癌旁组织为样本，采用AgilentTM高通量的microRNA微阵列芯片检测miRNAs的表达水平，应用配对t检验分析芯片数据，筛选食管鳞癌组织和癌旁组织中差异表达的内源性microRNAs。 结果： MicroRNA微阵列芯片检测的866个人类相关microRNA探针中，食管鳞癌组织与配对癌旁组织样本表达差异有统计学意义的microRNAs有15个 (P<0.05)：其中表达上调的有7个，分别为hsa_miR_20a， hsa_miR_155，hsa_miR_574_5p，hsa_miR_21，hsa_miR_183，hsa_miR_601，hsa_miR_623；表达下调的有8个，分别为hsa_miR_186，hsa_miR_10a，hsa_miR_144，hsa_miR_338_3p，hsa_miR_192，hsa_miR_218，hsa_miR_451，hsa_miR_139_5p。 结论： 在食管鳞癌组织和癌旁组织中初步筛选了15个差异表达的microRNAs，它们可能与食管鳞癌的发生和发展相关。

　　【关键词】 食管鳞癌； microRNA； 差异表达；微阵列

　　中图分类号： R735.1　　　　文献标识码： A　　　　文章编号： 1004－616X(2010)06－0418－05

　　【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To study the difference of microRNA expression profiles between esophageal squamous cell carcinoma(ESCC) tissues and adjacent tissues in Huai'an．The result of this study may provide theoretical support and experimental basis for further research on mechanism of microRNAs in the pathogenesis of esophageal squamous cell carcinoma. METHODS: Cancer tissues and corresponding normal esophageal tissues(NET) adjacent to tumor from 3 patients with newly diagnosed ESCC were obtained. Endogenous microRNAs were determined by high_throughput microRNA microarray．RESULTS: Among the 866 human relevant microRNA probes detected by microRNA microarray, the difference of fifteen microRNAs between esophageal cancer tissues and tissues adjacent to the tumors was statistically significant(P<0.05), including a set of 7 overexpressed microRNAs(hsa_miR_20a, hsa_miR_155, hsa_miR_574_5p, hsa_miR_21, hsa_miR_183, hsa_miR_601, hsa_miR_623) and 8 under_expressed microRNAs(hsa_miR_186, hsa_miR_10a, hsa_miR_144, hsa_miR_338_3p, hsa_miR_192, hsa_miR_218, hsa_miR_451, hsa_miR_139_5p). CONCLUSION: There was a special profile of differentially expressed microRNAs between ESCC and NET, which may be associated with the occurrence and development of esophageal squamous cell carcinoma.

　　【KEY WORDS】 esophageal squamous cell carcinoma; microRNA; differential expression; microarray

　　MicroRNAs(miRNAs)是一个长度为2l～25个核苷酸的非编码小RNA大家族，由具有发夹结构的70～90个碱基大小的单链pre_miRNA经过酶切加工后生成，人类基因组编码了超过1 000个miRNA。有关miRNA的研究分析提示，miRNA参与生命过程中一系列的重要进程，包括发育、造血、器官形成、凋亡、细胞增殖，甚至肿瘤发生[1]。近几年，恶性肿瘤中的miRNA表达异常越来越受到重视，现有研究表明miRNA与肿瘤发生密切相关[2]。因此，了解miRNA在正常组织与肿瘤组织中的差异表达，有助于明确与人类肿瘤相关的miRNAs，从而进一步研究其在肿瘤中的作用机制。由于高通量的微阵列技术的发展，使得miRNA基因组的研究日益深入。高通量微阵列技术由于具有联合检测，检测效率和灵敏度高，操作过程简化，样本需求量小等优势而被广泛应用。国内外学者运用miRNA微阵列研究发现了多种肿瘤存在miRNA的异常表达或缺失。

　　食管癌是人类常见的消化道恶性肿瘤，我国是食管癌高发地区之一，每年约有24 万新诊断的食管癌病例，约占全世界食管癌病例数的一半[3]。淮安是我国食管癌高发地区之一，其发病率和死亡率居高不下。目前食管癌临床治疗手段还很有限，预后较差，因此对食管癌高危险人群进行早期筛检和干预是降低食管癌发病率和死亡率，改善患者生存质量的关键。

　　本研究旨在应用高通量的miRNAs分析平台，用人microRNA寡核苷酸基因芯片在淮安地区食管鳞癌患者癌组织与癌旁组织中初步筛选差异表达的miRNAs，为进一步在淮安人群中进行与食管癌相关的miRNAs差异表达谱的构建奠定基础，以期用于淮安食管癌高危人群筛检和早期诊断。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　食管癌患者志愿者　本研究志愿者来自江苏淮安市第一人民医院。食管癌患者入选标准：经病理或内窥镜诊断明确的原发性食管癌患者，未经放、化疗，在淮安当地居住20年以上的汉族居民。

1.1.2　病例资料　经患者知情同意，本次研究选取了3名志愿者的食管癌和癌旁组织。3位患者均为男性，年龄分别为61、62和71岁。全部病例经过病理学检查确诊为初发食管中段鳞癌患者，未发现远处器官转移，术前未施行任何治疗。

1.1.3　样本采集及保存　外科手术切除癌原发灶后，迅速切取癌组织及距离癌组织5 cm以上的远端癌旁组织标本。将组织块剪至约0.5×0.5×0.5 cm3大小，用生理盐水冲洗后迅速置于液氮中保存。

1.1.4　主要仪器和试剂　试验中所用仪器主要包括生化分析仪2100 Bioanalyzer(Agilent)，杂交舱Hybridization Chamber(Agilent)，杂交舱垫片Hybridization Chamber gasket slides(Agilent)，杂交炉Hybridization oven(Agilent)和杂交炉转子Hybridization oven rotator(Agilent)，微阵列扫描仪Microarray Scanner(Agilent)。主要试剂为miRNA提取试剂盒mirVana RNA Isolation Kit(Ambion)，miRNA标记和杂交试剂盒miRNA Complete Labeling and Hyb Kit(Agilent)，基因表达清洗缓冲液Gene Expression Wash Buffer Kit(Agilent)等。

1.1.5　miRNA芯片分析　microRNA微阵列基因芯片和质控探针由美国Agilent公司提供，采用AgilentTMmicro RNA微阵列芯片技术平台，其miRNA探针序列信息来自于Sanger miRBase Release 13.0版本数据库(http://microma.anger.ac.uk/sequences/)，涵盖了该数据库中866个人类相关miRNA探针。每张芯片都设计了与实验样品无同源性的核酸序列作为质控RNA，用于芯片合成、样品标记以及杂交实验的质量控制。芯片含有9个阳性参照，6个阴性参照，组织内源的5 S rRNA作为miRNA芯片杂交的内源阳性对照。阴性对照包括空白对照和与实验样品无同源性的核酸序列探针。

1.2　方法

1.2.1　总RNA的提取　采用miRNA提取试剂盒mirVana RNA Isolation Kit分别提取癌组织和癌旁组织标本总RNA，具体方法按说明书进行。用生化分析仪2100 Bioanalyzer定量，琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的完整性。

1.2.2　miRNA标记和杂交　取提取后的总RNA 100 ng，进行去磷酸化处理。样品中加入去磷酸化混合液，37 ℃孵育30 min。随后向样品中加入DMSO，100 ℃金属浴5～10 min后，迅速放入冰水浴中。向冰浴后的样品中加入连接反应混合液，16 ℃温育2 h。反应结束后，将样品置于真空浓缩仪中完全抽干，重新溶解在无核酸酶去离子水中，加入10×GE 封闭溶液和2×Hi_RPM 杂交缓冲液，100 ℃金属浴5 min后冰浴5 min。准备杂交反应混合液，组装杂交舱。将杂交舱平衡放置在杂交炉的架子上，55 ℃，20 r/min杂交20 h。

1.2.3　芯片扫描及数据分析　杂交结束后，洗涤芯片。将芯片正确放置在芯片架中，然后将其放入扫描仪上用Agilent Scan Control software软件扫描。用图像分析软件Agilent G4450AA Feature Extraction software 9.5将图像转化为基于荧光强度的数字信号，在Ahilent GeneSpring software GX9.0中进行数据的分析、统计和处理，筛选出差异表达基因。差异表达miRNA筛选标准为：在重复实验中信号检测结果显示变化方向和程度一致，癌组织和癌旁组织的荧光信号强度差异有统计学意义(配对t检验，P<0.05)。

2　结　果

2.1　总RNA提取质量分析

　　3对样品总RNA电泳结果显示(图1)，各样本的RNA在18 S和28 S处均可见明显的峰值，对分离纯化获得的RNA进行吸光度[D(λ)]值测定(表1)，3例食管癌患者的癌组织和癌旁组织样本浓度跨度为0.195～0.646 μg/μl，D(260)/D(280)基本在2.00左右，表明RNA总量及质量符合miRNA微阵列的检测要求。

2.2　杂交数据的分布特征

　　将3对食管癌组织和癌旁组织的芯片杂交的原始数据经过均一化和对数转换以后绘制成Box_Whisker plot箱线图，见图2，用以评估芯片杂交数据的分布和分散程度。由图2可见，各芯片的杂交数据经变换后数据基本对称，符合正态分布的特征。

2.3　microRNA的差异表达分析

　　对3对食管癌组织和癌旁组织进行差异表达的microRNA分析，筛选出荧光信号强度差异具有统计学意义(P<0.05)的microRNA 共15个(表2)，其中在癌组织中表达上调的有7个，分别为hsa_miR_20a，hsa_miR_155，hsa_miR_574_5p，hsa_miR_21，hsa_miR_183，hsa_miR_601，hsa_miR_623；表达下调的有8个，分别为hsa_miR_186，hsa_miR_10a，hsa_miR_144，hsa_miR_338_3p，hsa_miR_192，hsa_miR_218，hsa_miR_451，hsa_miR_139_5p。

3　讨　论

　　随着分子生物学理论的发展和分子检测技术的突破，非编码RNA(non_coding RNA)，特别是miRNA已成为近年来的研究热点。miRNA是调节基因表达、调节生长发育和维持机体正常生理功能的一类重要小分子RNA，广泛存在于哺乳动物细胞内，具有强大的调控基因表达的作用，主要通过降解靶mRNA和抑制靶mRNA的翻译两种作用方式调控基因的表达。近年来，针对miRNA与肿瘤的关系已开展了大量的研究。研究发现，肿瘤细胞与正常组织来源细胞间miRNA表达谱具有明显差异，且多数miRNA基因位于与肿瘤形成相关性脆弱基因位点，提示miRNA 在肿瘤形成过程中可能扮演着重要的角色[4]。Lu等[5]发明了一种具有高度特异性磁珠流式细胞技术，系统地分析了334种淋巴瘤和实体瘤中miRNA的表达谱，并首次认为miRNA水平可用于肿瘤的诊断和分期。Mitchell等[6]用qRT_PCR技术在前列腺癌患者血清中检测到miR_141，进一步证明了miRNA可作为肿瘤诊断的循环系统分子标志，增加了miRNA表达谱作为临床诊断指标的可能性。因此，识别特异性肿瘤相关 miRNAs已成为肿瘤早期发现和诊断性生物标志研究的一个新的研究热点。

　　现有实验和临床研究证据显示，miRNA可以作为一类新的肿瘤“原癌基因”或者肿瘤“抑癌基因”，通过促进或抑制肿瘤原癌基因或抑癌基因的表达，从而调控肿瘤细胞的增殖和凋亡。如有研究发现，miR_17_92作为原癌miRNA，参与了包括恶性淋巴瘤在内的多种肿瘤的发生发展过程[7]。此外，多项研究表明，在线虫中最早发现的miRNA之一的Let_7在哺乳动物中负性调控多种癌基因和细胞周期调节因子，可能是一个肿瘤抑制基因[8]，其低表达与人类多种肿瘤尤其是肺癌的发生发展有关。Iorio等[9]发现mir_10b、mir_125b、mir_145、mir_21和mir_155等在乳腺肿瘤和正常组织中的表达存在差异，而且miRNA表达水平与雌激素受体水平、孕激素受体水平、淋巴结转移、增殖指数、Cerb_B2和p53表达水平等密切相关。Cimmino等[10]发现B细胞慢性淋巴细胞白血病与mir_15a和mir_16_1关系密切，它们可能通过转录后抑制Bcl_2表达，从而表现抑制肿瘤生成的作用。Muakami等[11]对肝癌组织和癌旁正常组织的miRNAs表达谱进行分析时，发现癌组织中mir_18、pre_mir_18和mir_224比正常组织表达显著升高，miR_199a3、 miR_195、 miR_199a、 miR_200a、miR_125a较正常组织表达降低，指出对这些miRNAs的检测可能有助于肝癌的分型和早期诊断。以上相关研究都表明miRNAs的差异性表达普遍存在于不同类型的肿瘤中，而且表达水平的变化与机体的激素水平、癌基因和抑癌基因的表达水平、肿瘤的类型和病程等因素密切相关。这些miRNAs与不同肿瘤的关联提示其可能成为肿瘤早期发现和早期诊断的候选生物标志。

　　尽管大量研究证实特定miRNA在细胞生长、分化和凋亡等活动中起着重要的调控作用，但是应用单一的miRNA指标进行特定肿瘤的筛检和诊断很难保证较高的灵敏度和特异性。关于多种人类癌症的系统性研究表明，特定miRNA表达谱可以反映肿瘤的发育起源和分化特征。因此，识别肿瘤特异miRNA表达谱用于肿瘤的早期发现和诊断有助于提高肿瘤生物标志的特异性和灵敏度。本研究在3对食管癌组织和癌旁组织中共筛选出15个差异表达miRNAs，在癌组织中表达上调的有7个(hsa_miR_20a， hsa_miR_155，hsa_miR_574_5p，hsa_miR_21，hsa_miR_183，hsa_miR_601，hsa_miR_623)，表达下调的有8个(分别为hsa_miR_186，hsa_miR_10a，hsa_miR_144，hsa_miR_338_3p，hsa_miR_192，hsa_miR_218，hsa_miR_451，hsa_miR_139_5p)。其中，miR_21在结肠癌、 肺癌、 胰腺癌、 前列腺癌、 胃癌、 乳腺癌等多种实体肿瘤中表达上调，提示其对肿瘤的作用可能具有普遍性[12]。此外，有研究报道miR_155与乳腺癌的发病风险密切相关，通过调控癌基因Cerb_B2的表达进而影响肿瘤的发生[13]。魏任雄等[14]发现miR_144在骨肉瘤中表达水平显著下调。部分食管癌相关miRNAs的研究也识别了一些癌组织和癌旁组织中差异表达显著的miRNA，如miR_103、miR_107、miR_25、miR_130b、miR_194、miR_192、miR_21、miR_203、miR_205等[15]。这些研究表明同一miRNAs可参与多种肿瘤的发生发展，而特定类型肿瘤的发生涉及多种miRNA的调控异常。因此，研究食管癌特异的miRNAs表达谱对于疾病筛检和肿瘤形成的机制研究具有重要价值。

　　本研究选取了3对组织样本进行了miRNAs的差异表达分析，样本量较小，但是我们采用的是配对分析，即每一对癌组织与其癌旁组织均来自同一患者，结果的可比性好，检验效率有所提高，能在一定程度上弥补样本量小的问题。同时，与常规分析miRNA的方法(如Real Time PCR，Northern blotting等)相比，本研究选用的微阵列芯片分析有着以下优点：①高通量，检测谱广。本研究采用的AgilentTMmicroRNA微阵列芯片技术平台，其miRNA探针涵盖了866个人类相关miRNA探针信息，每张芯片都设计了与实验样品无同源性的核酸序列作为质控RNA，含有9个阳性参照，6个阴性参照，从而保证了结果的高准确性。②高特异性。微阵列芯片特殊的探针设计能区分成熟miRNA和miRNA前体，最少能区别1个碱基的差异。③高灵敏度。与荧光定量PCR分析相比，微阵列芯片分析无需对样品进行PCR扩增，避免了扩增过程对原始信号的影响；而且，微阵列芯片采用高灵敏度的荧光信号检测，其丰度跨4个log，最高可达6个log，只要存在6 000个拷贝的分子就可以检出。这些方面保证了微阵列芯片的miRNA检测范围广，灵敏度高，特异性好。目前，我们正在大规模人群中采用实时荧光定量PCR方法对此次初筛的差异表达miRNAs进行验证性研究，以明确与淮安食管癌相关的差异表达miRNAs，构建食管癌相关microRNAs差异表达谱，并通过进一步分析差异表达miRNAs在食管癌发生中的作用，识别影响食管癌发病的关键miRNAs及其调控机制，以期发现食管癌特异的miRNAs标志，用于淮安食管癌高危人群筛检和早期诊断。

参考文献

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收稿日期： 2010－06－08； 修订日期： 2010－10－13

基金项目： 国家自然科学基金(30671732, 30800891,81072259)；高等学校博士学科点专项科研基金(200802861045)；江苏省自然科学基金(SBK201022665)

作者简介： 刘　辉(1985－　)，男，内蒙古赤峰市人，硕士研究生，研究方向: 肿瘤环境基因组学。

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