张　倩/赵连梅/张建彬/单保恩

(河北医科大学第四医院科研中心， 河北 石家庄 050011)

Expression of spleen tyrosine kinase in human esophageal squamous cell carcinoma

ZHANG Qian， ZHAO Lian_mei， ZHANG Jian_bin， SHAN Bao_en

(Research Center, The Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011,Hebei, China)

　　【摘要】 目的: 探讨脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase, Syk)在食管鳞状细胞癌组织中的表达及其临床意义。 方法: 采用逆转录_聚合酶链反应(RT_PCR) 检测30例食管鳞癌组织、27例食管鳞癌癌旁组织及30例相对正常食管黏膜组织中Syk mRNA的表达；应用免疫组化技术检测39例食管鳞癌组织、27例食管鳞癌癌旁组织及38例相对正常食管黏膜组织中Syk蛋白的表达并分析其与临床病理学指标间的关系。结果: 食管鳞癌组织中Syk mRNA表达高于癌旁组织和正常食管黏膜组织，但差异无统计学意义(P>0.05)。Syk蛋白在食管鳞癌组织中的阳性率(34/39，87.2％)明显高于食管鳞癌癌旁组织(18/27,66.7％)和正常食管黏膜组织(26/38,68.4％)(P<0.05)。Syk蛋白表达与食管鳞癌患者年龄、性别、肿瘤大小、临床分期均无明显相关关系(P均>0.05)。 结论: Syk mRNA和蛋白在食管鳞癌组织中表达增高，但Syk蛋白表达与临床病理学指标无相关关系。

　　【关键词】 脾酪氨酸激酶； 食管鳞状细胞癌； 临床病理学指标

　　中图分类号： R735.1　　　　文献标识码： A　　　　文章编号： 1004－616X(2010)06－0423－05

　　【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To explore the expression and its clinical significance of Syk (spleen tyrosine kinase) gene in human esophageal squamous cell carcinoma(ESCC). METHODS: The expressions of Syk gene in human esophageal carcinoma lesions(n=30), peri_cancerous tissue(n=27) and relative normal tunica mucosa of esophageal tissue(n=30) were detected by Reverse transcription_polymerase chain reaction(RT_PCR) technique. Immunohistochemistry was used to detect Syk protein expression in the above cases and analyzed their relationships with clinicopathologic data of the patients. RESULTS: The differences of Syk mRNA levels among the human esophageal carcinoma lesions, peri_cancerous tissue and relative normal tunica mucosa esophageal tissue were not significant(P>0.05). But the level of Syk mRNA was obviously higher the carcinoma lesions than the normal esophageal tissue. Of the 39 esophageal carcinoma lesions, 34 were Syk protein positive(34/39, 87.2％), expression of Syk protein were detected in 18 peri_cancerous tissue(18/27, 66.7％) and in 26 of the 38 relative normal tunica mucosa esophageal tissue(26/38，68.4％). A significant difference was noted among three groups(P<0.05). Furthermore, Syk protein expression was not associated with the patients′ sex, age, tumor size and stages(P>0.05). CONCLUSION: Expressions of Syk mRNA and Syk protein in ESCC were significantly higher and unrelated to clinicopathologic characteristics.

　　【KEY WORDS】 spleen tyrosine kiase; human esophageal squamous cell carcinoma(ESCC); clinicopathologic characteristics

　　我国是食管癌高发区，直接受威胁人口达2亿，严重威胁着人们的身心健康。目前，食管癌的主要治疗手段仍然是根治性手术切除。然而，仍有许多病人术后复发和远处转移，以致手术达不到预期效果。食管癌的发生与发展受多基因的复杂调控，包括癌基因激活和抑癌基因突变或失活。蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase, PTKs)是一组能催化底物蛋白酪氨酸残基磷酸化的酶蛋白，参与多种信号转导途径，并在控制细胞分化、增殖和扩散中起重要作用。其中，脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase, Syk)表达低下或表达缺失与肿瘤发生、侵袭浸润关系密切。但目前有关Syk表达与食管鳞癌发生、发展关系的研究鲜见报道。本研究采用RT_PCR、SP免疫组化法分别检测食管鳞癌、食管鳞癌癌旁组织和相对正常食管黏膜组织中Syk mRNA和Syk蛋白的表达，并结合病理组织学检查结果进行统计学分析，旨在探讨Syk表达与食管鳞癌生物学行为的相关关系。

1　材料与方法

1.1　材料来源

　　选取河北医科大学附属第四医院2009年6月至2010年1月手术切除的食管癌标本。食管癌组织(均经组织病理学检查确诊为食管鳞状细胞癌)39例、食管癌旁非癌组织(肿瘤组织旁2 cm)27例、食管相对正常黏膜组织(手术切除标本食管最远端，距肿瘤组织>5 cm)38例，液氮速冻后，置－70 ℃保存备用。患者年龄43～74 岁，中位年龄59 岁，男 24例，女15例。本组患者中伴有局部淋巴结转移者20例，无转移者19例。按1997年食管癌国际TNM分期标准进行分期。所有标本均经组织病理学检查确诊为食管鳞状细胞癌。所有患者术前均未进行放疗、化疗及激素治疗。

1.2　主要试剂

　　Trizol试剂(美国Invitrogen公司)，RT_PCR试剂盒(Promega公司)，琼脂糖(Sigma公司)。引物由上海捷瑞生物技术有限公司合成，Syk(514 bp)上游引物：5′_CATGTCAAGGATAAGAACATCATAGA_3′；下游引物：5′_AGTTCACCACGTCATAGTAGTAATT_3′；β_actin(312 bp)上游引物：5′_GTTGTGATGGGTTCTGA_3′；下游引物： 5′_GAGCAATAGCGTCTGTG_3′。SP免疫组化试剂盒(河北博海生物公司)、DAB显色试剂盒(中杉金桥生物公司)，鼠抗人Syk单克隆抗体(Santa Cruze公司)。

1.3　实验方法

1.3.1　半定量RT_PCR检测Syk mRNA表达　组织标本放入研钵中并倒入液氮研磨，组织磨碎后加入1 ml Trizol，移至1.5 ml EP管中。在冰上放置5 min，用常规氯仿_异丙醇抽提、75％乙醇沉淀RNA，最后用30 μl双蒸水溶解。－80 ℃保存备用。紫外分光光度计测定其纯度和含量。取2 μl RNA 70 ℃预热10 min后，依次加入25 mmol/L MgCl2、 dNTP、 AMV、 10×Buffer、 oligo dT及RNAsin，最后加去离子水至20 μl。反转录反应条件为25 ℃ 1 min， 42 ℃ 60 min，98 ℃ 5 min，反应产物作为PCR的cDNA模板。然后依次加入上、下游引物各2.5 μl和Go_Taq酶12.5 μl，加入去离子水使总反应体积为25 μl，进行PCR反应。RT_PCR扩增条件为：95 ℃ 2 min；94 ℃ 60 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min；共35个循环。取扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统分析并拍摄图像，采用Gel_Pro Analyzer 3.1分析软件分析条带灰度值，mRNA表达相对值为目的片段灰度值/β_actin灰度值。

1.3.2　免疫组化(SP二步法)检测Syk蛋白表达　食管癌、癌旁及食管正常黏膜组织分别经固定后制成组织蜡块，以5 μm厚度切片进行免疫组化染色：二甲苯脱蜡，酒精梯度水化；热修复抗原，在10 nmol/L枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)中煮沸10 min；冷却后用0.3％甲醇过氧化氢修复20 min；PBS漂洗5 min×2次，滴加适宜浓度A液，温箱放置45 min；擦拭玻片后直接滴加1:100稀释的抗Syk一抗，4 ℃过夜；PBS漂洗5 min×2次，滴加适宜浓度B液，温箱放置30 min；PBS漂洗5 min×2次，滴加适宜浓度C液，温箱放置30 min；PBS漂洗5 min×2次，用DAB显色3～5 min；苏木素复染、脱水、封片。结果判定标准：Syk以细胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞，观察镜下阳性细胞数(×400倍)，≤10％为1分，>10％～50％为2分，>50％～75％为3分，>75％为4分；染色强度(×100倍)，无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；两类百分数之和<3分记为阴性，满3分记为阳性(＋)，4分为较强阳性(＋＋)，≥5分为强阳性(＋＋＋)。

1.4　统计学方法

　　所有数据应用SPSS13.0统计软件分析，计量资料统计描述采用－±s，多个独立样本的均数比较采用非参数检验(Kruskal_Wallis H检验)。计数资料的比较采用χ2检验及Fisher确切概率法，以α=0.05为检验水准。

2　结　果

2.1　Syk mRNA在食管鳞癌、癌旁和正常食管黏膜组织中的表达　

　　结果如图1显示，食管鳞癌组织与癌旁组织及正常食管黏膜Syk mRNA的相对表达强度不同。Syk mRNA灰度值分析显示，在30例食管鳞癌、27例癌旁组织和30例正常食管黏膜组织中Syk mRNA的相对表达量分别为0.90±0.88、0.61±0.42、0.61±0.36，3者间的差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2　Syk 蛋白在食管鳞癌、癌旁和正常食管黏膜组织中的表达　

　　Syk蛋白在39例食管鳞癌组织、27例癌旁组织和38例食管正常黏膜组织中的表达见图1和表1。3组间Syk蛋白表达差异具有统计学意义(P=0.007)，食管鳞癌组织中Syk蛋白表达率明显高于食管鳞癌癌旁组织和正常食管黏膜组织(P<0.05)。

2.3食管鳞状细胞癌Syk蛋白表达与临床病理指标之间的关系

　　Syk蛋白表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期均无明显相关关系(P均>0.05)，见表2。

3　讨 论

　　Syk基因最初于1991年由日本学者Taniguchi等[1]从猪脾的cDNA中克隆出来，为Syk家族两个成员(Syk和ZAP_70)之一，定位于染色体9q22，其编码的蛋白质分子量为72 kD，由629个氨基酸组成。最初对Syk的研究集中于其对造血细胞尤其是免疫细胞如B淋巴细胞[2]、T淋巴细胞、血小板、自然杀伤细胞等的作用。近年来,有研究认为其在多种恶性肿瘤的发病过程中起着极为重要的作用[3]。大量研究先后证明在多种肿瘤如乳腺癌[4－5]、胃癌[6－7]、肝细胞癌[8]、胰腺癌[9－10]、结直肠癌[11]等的肿瘤组织中亦广泛存在Syk表达缺失的现象。然而，对于其在食管癌组织中的表达报道尚少。

　　本研究发现，在30例食管鳞癌、27例食管鳞癌癌旁组织和30例正常食管黏膜组织中Syk mRNA的表达间的差异无统计学意义(P>0.05)。食管癌与癌旁组织和正常食管黏膜组织相比，Syk mRNA表达量虽然比较高，但差异无统计学意义。这与Sutima L 等[12]的研究结果类似，后者对头颈部鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma of the head and neck,SCCHN)中的Syk 表达进行了研究，结果显示，Syk在SCCHN肿瘤组织中的表达高于正常组织，但并没有统计学差异。

　　Coopman等[4]首先发现，Syk广泛存在于人类正常乳腺组织、良性病变和低负荷肿瘤组织中，但在侵袭性乳腺癌中，Syk mRNA(RT_PCR检测)和Syk蛋白(Western blot 检测)表达减少或缺失。Moroni等[5]通过原位杂交技术发现，在正常乳腺组织、不典型增生、原位癌、浸润性癌中，Syk mRNA依次减少。袁世龙等[6]研究发现胃癌组织中Syk mRNA和Syk蛋白的表达率明显低于癌旁胃组织, Wangs等[7]对一组胃癌病人的研究发现，胃癌组织Syk基因表达低于相邻正常胃组织(P<0.05)。宋玉琴等[10]研究认为Syk蛋白的低表达与胰腺癌的发生发展有关，Syk蛋白在正常胰腺组织中全部表达，在慢性胰腺炎中呈中等表达，在胰腺癌中弱阳性表达，与前两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。国内学者万伟等[11]研究发现，Syk基因在结直肠癌的表达率为38.7％，Syk的表达与结直肠癌的肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移相关。

　　本研究发现，食管鳞状细胞癌组织Syk蛋白表达率明显高于癌旁组织和正常食管黏膜组织。这与Sutima等[12]的研究结果类似，后者应用免疫组化方法检测的SCCHN组织发现，尤其在小肿瘤组织簇中有明显的胞质着色。然而，这一结果与乳腺癌[12－15]及胃腺癌[16]的相关研究相反。其原因可能与Syk在不同组织学来源的肿瘤细胞中发挥不同生物学作用有关。另一个重要的原因为，有研究发现[17－18]，在乳腺肿瘤中Syk有S 和L两种表达形式，Syk(S)型与肿瘤的侵袭性相关，Syk(L)型有抑制肿瘤侵袭性的功能。可能是不同的亚型在不同肿瘤组织中存在表达差异，因为尚无抗Syk(S)和Syk(L)的单克隆抗体问世，因此尚无法进行这方面的进一步研究。

　　本实验结果Syk mRNA表达水平与Syk蛋白表达水平并不完全相符，有可能是在鳞状细胞癌发生发展过程中，Syk在转录后修饰过程中发生了某种变化，或者与样本含量有关，但具体机制尚不清楚。这与刘泓基等[19]的研究结果不同，后者研究认为Syk蛋白和mRNA在食管鳞癌癌旁组织中阳性表达率明显高于食管鳞癌肿瘤组织中的阳性表达率。

　　本研究还发现，Syk的表达与食管鳞癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期等无明显相关关系(P>0.05)。这与刘泓基等[19]的研究结果不甚相同，原因可能是本实验标本取自于食管鳞癌高发区的河北，而刘等研究的标本来自散发于广西的食管鳞癌患者。究竟是否由于地域、生活环境、饮食结构、民族差异、个体素质，还是基因水平的差异，尚不清楚。

　　Syk作为一个候选的抑癌基因在腺上皮细胞中Syk表达缺失已经得到广泛证实，但其在鳞状上皮中的研究尚少，究竟Syk的表达是不是存在组织学特异性，尚需要继续研究。其在不同组织学来源的组织以及细胞中的表达以及相关生物学作用机制有待于进一步探索，为早日阐明Syk在肿瘤中的生物学作用奠定基础。

参考文献

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[7] Wang S, Ding YB, Chen GY, et al. Hypermethylation of Syk gene in promote region associated with oncogenesis and metastasis of gastric carcinoma[J]. World J Gastroenterol, 2004,10(12):1815－1818.

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收稿日期： 2010－07－25； 修订日期： 2010－09－08

基金项目： 国家自然科学基金(30772752)，河北省自然科学基金(C2008000952)

作者简介： 张　倩(1985－　)，女，河北保定人，硕士研究生，研究方向:肿瘤免疫。

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