苏中静1/陈海滨1/宋旭红2/徐晓园2/王　宁1/刘小辉1/黄东阳2,

(1.汕头大学医学院组织胚胎学教研室，广东 汕头 515041;2.汕头大学医学院细胞生物学教研室，广东汕头 515041)

The effects of all_trans retinoic acid on the cytoskeleton and  growth of esophageal carcinoma cell line EC109

SU Zhong_jing1, CHEN Hai_bin1, SONG Xu_hong2, XU Xiao_yuan2, WANG Ning1, LIU Xiao_hui1, HUANG Dong_yang2,

(1.Department of Histology and Embryology; 2. Department of Cell Biology, Shantou University Medical College, Shantou 515041,Guangdong, China)

　　【摘要】 目的： 观察全反式维甲酸(all_trans retinoic acid，atRA)对食管癌EC109细胞的增殖、凋亡以及细胞骨架微丝的调节作用。 方法： 不同浓度的atRA作用食管癌EC109细胞48 h后，相差显微镜观察细胞的生长状态，MTT检测细胞的增殖，Annexin V_FITC染色后通过流式细胞仪检测细胞的凋亡，荧光标记的鬼笔环肽染色观察细胞骨架的形态和分布。结果： 0.1、1、2、5 μmol/L atRA作用48 h后细胞形态均未见明显的异常。MTT检测显示，0.1、1、2、5 μmol/L atRA作用组细胞的相对增殖比例(以对照组为1)分别为98.29％、93.15％、89.92％、81.03％，其中5 μmol/L atRA作用组与对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪检测0.1、1、2、5 μmol/L atRA组早期凋亡细胞的比例分别为0.65％、0.94％、0.93％和0.94％，与对照组(0.70％)相比差异均无统计学意义(P>0.05)。荧光标记染色显示2 μmol/L和5 μmol/L atRA作用24 h后细胞骨架失去典型的丝状结构，出现排列紊乱。结论： atRA对食管癌EC109细胞无明显的凋亡诱导作用，但高浓度的atRA对食管癌细胞具有一定的生长抑制作用，并有可能通过细胞骨架调节细胞的分裂和增殖。

　　【关键词】 维甲酸； 食管癌细胞； 增殖； 细胞骨架

　　中图分类号： R735.1　　　　文献标识码： A　　　　文章编号： 1004－616X(2010)06－0428－05

　　【ABSTRACT】 OBJECTIVE:To study the effects of all_trans retinoic acid(atRA) on the proliferation, apoptosis and cytoskeleton microfilaments of esophageal carcinoma cells EC109. METHODS： After exposed to atRA for 48 h, the morphological structure of EC109 cell were examined under phase contrast microscope, and MTT assay was applied to evaluate cell growth. The apoptic cells were stained with Annexin V_FITC and detected by flow cytometry. The cytoskeleton microfilaments were studied with fluorescence microscope after staining with FITC_labelled phalloidin. RESULTS： The proliferation ratios of 0.1, 1, 2, 5 μmol/L atRA_treated group were 98.29％, 93.15％, 89.92％ and 81.03％, respectively, with significant difference between 5 μmol/L atRA_treated group and control group (P<0.05). Cells in early stage of apoptosis of treated groups were 0.65％, 0.94％, 0.93％, 0.94％, respectively, but without significant difference when compared with control group. The cytoskeleton was re_arranged and lost the typical filamentous structure after EC109 cells were exposed to 2 μmol/L and 5 μmol/L atRA for 24 h. CONCLUSION： Present study did not show atRA induced apoptosis of esophageal carcinoma cell line EC109, while atRA at high concentration demonstrated a potential to inhibit the growth of esophageal carcinoma cells. It is possible that atRA regulates the proliferation and growth of esophageal carcinoma cells through cytoskeleton changes.

　　【KEY WORDS】 retinoic acid; esophageal carcinoma cell; proliferation; cytoskeleton

　　维甲酸是体内参与细胞生长、增殖和分化调节的重要信号分子。维甲酸有9_顺式、11_顺式、13_顺式、双顺式以及全反式等多种形式，全反式维甲酸(all_trans retinoic acid，atRA)是维生素A在体内代谢的主要活性形式[1]。上世纪80年代末，我国学者首先发现atRA能诱导急性早幼粒细胞性白血病的肿瘤细胞向正常方向分化，并成功的用于抗白血病的治疗[2]，至今，这一疗法已在急性粒细胞白血病的临床治疗中取得了明显的疗效[3－4]。维甲酸对其他非血液系统实体瘤细胞的作用因细胞不同而有不同的作用效果[5－8]。我国是食管癌的高发地区，每年因食管癌死亡者约15万人，占全部恶性肿瘤死亡人数的近1/4[9－10]。因此，我们用atRA处理食管癌EC109细胞，观察atRA对食管癌细胞系的作用效果，并探讨其可能的作用机制。

1　材料与方法

1.1　肿瘤细胞的培养和atRA处理

　　人食管癌上皮EC109细胞为本实验室保存，细胞复苏后培养于含10％胎牛血清(Gibco)的RPMI 1640培养基中。细胞于37 ℃，5％CO2生长至80％～90％覆盖率时用0.25％胰酶消化传代。在培养过程中分别加入终浓度为0.1、1、2、5 μmol/L的atRA(Sigma)共同孵育48 h的为实验组，未加atRA的为对照组。在相差显微镜(Olympus)下观察细胞的生长情况并拍摄照片。

1.2　MTT检测细胞的增殖

　　于96孔细胞培养板中，每孔接种食管癌EC109细胞5×103个。分别加入0.1、1、2、5 μmol/L的atRA培养48 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT溶液(Sigma)10 μl，37 ℃，5％ CO2孵育4 h，PBS洗3次，加入酸化异丙醇溶液(0.1 mol/L HCl＋无水异丙醇)100 μl，细胞裂解后全自动酶联检测仪570 nm(630 nm校准)测各孔的吸光度值，记录实验结果。每组设3个复孔，同时设置调零孔。每组实验重复3次，以对照组为0，按下式计算atRA作用组的细胞增殖率。

　　细胞增殖率=(实验组吸光度值－空白对照组吸光度值)/(对照组吸光度值－空白对照组吸光度值)×100％

1.3　流式细胞技术检测细胞的凋亡

　　采用Annexin V_FITC凋亡检测试剂盒(凯基生物)检测atRA对食管癌EC109细胞的凋亡作用。方法为：EC109细胞按每孔2×105个接种于6孔板，分别加入0.1、1、2、5 μmol/L的atRA培养48 h后胰酶消化收集细胞，PBS洗涤重悬细胞并调整细胞浓度为1×106/ml。加入Annexin V_FITC和碘化丙啶(PI)室温下避光孵育15 min，PBS洗涤后经流式细胞仪检测分析。

1.4　免疫荧光染色观察细胞骨架微丝的结构

　　无菌盖玻片放置于3.5 cm培养皿中，将EC109细胞加于盖片上，分别加入0.1、1、2、5 μmol/L的atRA，37 ℃、5％ CO2培养24 h后取出盖片。4％多聚甲醛固定5 min，0.4％ SDS＋0.02％ Triton X_100穿孔。再加入5 mg/ml FITC_鬼笔环肽(FITC_phalloidin，Alexis)室温下染30 min。0.3 μg/ml DAPI(Sigma)染2 min，PBS洗涤后用60％缓冲甘油封片，Olympus BX51荧光显微镜观察并拍照。

1.5　统计学方法

　　数据应用SPSS13.0及Excel统计软件进行t检验。以α=0.05为检验水准。

2　结　果

2.1　atRA处理肿瘤细胞的形态学特征

　　食管癌EC109细胞呈单层贴壁生长，0.1、1、2、5 μmol/L atRA作用48 h后细胞形态均未见明显的异常(图1)，但5 μmol/L atRA作用组细胞的覆盖率相对较低，分裂相细胞减少。

 2.2　atRA对细胞增殖的影响

　　MTT检测不同浓度的atRA作用后细胞的吸光度值，以对照组为1，计算atRA作用的相对增殖比例，0.1、1.0、2.5 μmol/L浓度组分别为98.29％、93.15％、89.92％、81.03％，对应的肿瘤细胞生长抑制率为1.71％、6.85％、10.08％、18.97％，结果显示5 μmol/L atRA作用组与对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.3　atRA对细胞凋亡的影响

　　用Annexin V和PI双染后，经流式细胞仪检测分析显示对照组、0.1、1、2 和5 μmol/L atRA 作用后，各组早期凋亡细胞的比例分别为0.70％、0.65％、0.94％、0.93％和0.94％(图2)，但与对照组相比，差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.4　atRA对细胞骨架结构的影响

　　FITC标记的鬼笔环肽染色微丝观察EC109细胞，其细胞骨架呈丝状分布在胞质中，2 μmol/L和5 μmol/L atRA作用24 h后，微丝排列紊乱，失去典型的束状张力丝结构。DAPI复染的细胞核形态规则，与对照组无明显差异(图3)。

3　讨　论

　　维甲酸是细胞内重要的信号传导分子，通过与细胞核内的受体结合，对成体细胞的生长、增殖以及胚胎的分化发育发挥调节作用[1, 11]。我们用不同浓度的atRA作用食管癌EC109细胞，通过活细胞观察和MTT检测细胞的生长和增殖，发现0.1、1、2 μmol/L的atRA对肿瘤细胞的生长没有明显改变，当浓度提高到5 μmol/L后，食管癌细胞生长受到抑制。维甲酸最早用于肿瘤的治疗是由于atRA可以与早幼粒白血病/维甲酸受体α融合蛋白(promyelocytic leukemia/retinoic acid receptor α，PML/RARα)结合诱导白血病细胞向正常方向分化[12]，随后又有研究发现维甲酸也可以抑制肝癌[5]、卵巢癌[6]、甲状腺癌[7]等细胞的生长，但维甲酸对膀胱移行上皮来源的肿瘤细胞没有明显的效果[8]。我们以食管癌EC109细胞为对象，发现atRA对食管癌细胞生长也有一定程度的抑制作用，但作用的有效浓度应不低于5 μmol/L。

　　另外，以往的研究发现，维甲酸的衍生物能通过内质网应激等多种途径诱导细胞凋亡[13－14]。为检测atRA对EC109细胞的凋亡作用，我们用Annexin V染色后通过流式细胞仪计数分析凋亡细胞。Annexin V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧，故荧光标记的Annexin V可作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。流式细胞检测结果显示0、0.1、1、2和5 μmol/L atRA作用后，早期凋亡细胞的比例分别为0.70％、0.65％、0.94％、0.93％和0.94％，而与对照组相比，通过MTT检测吸光值计算0.1、1、2和5 μmol/L atRA作用组的相对细胞增殖比例为98.29％、93.15％、89.92％和81.03％，进一步计算atRA对EC109细胞的生长抑制率为1.71％、6.85％、10.08％和18.97％。结合晚期凋亡和死细胞，可以看出凋亡不是导致食管癌EC109细胞生长抑制的主要原因，有可能维甲酸衍生物与atRA在作用机制上还存在一定的差异。

　　通过FITC标记的鬼笔环肽染色，我们发现2 μmol/L和5 μmol/L atRA作用后，细胞骨架微丝的形态结构与对照组相比，失去了典型的束状分布特点，出现排列紊乱的现象。以往也有文献报道维甲酸具有抑制细胞迁移和运动的能力[15－17]。细胞骨架在细胞分裂、增殖和运动中发挥重要作用，因此我们推测atRA有可能通过细胞骨架抑制食管癌细胞的生长。并且维甲酸在细胞内主要与核受体RAR和RXR结合，调控基因的转录活性[18]。通过生物信息学分析，我们发现在fascin等骨架相关蛋白基因的启动子区域存在维甲酸受体RXR的结合序列，既往也有研究发现维甲酸作用后细胞骨架相关蛋白的表达发生改变[15－16, 19]。因此，atRA作为细胞内的信号分子，有可能通过核受体介导的机制调节细胞的骨架活动进而影响细胞的增殖和分裂。

　　本研究通过观察atRA对食管癌EC109细胞的增殖、凋亡和细胞骨架的影响，我们发现维甲酸虽然无明显诱导食管癌EC109细胞凋亡的作用，但有可能通过细胞骨架或其它机制抑制细胞的分裂从而抑制肿瘤细胞的生长。虽然atRA用于临床急性早幼粒细胞性白血病的治疗取得了较好的临床效果并显示出了对肝癌等实体瘤的应用前景，但在食管癌EC109细胞，5 μmol/L维甲酸的肿瘤生长抑制率仅18.97％，而5 μmol/L的浓度在临床上已具有相对高的毒性和副作用，提示似乎atRA对于临床食管癌的应用还存在一定距离。

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收稿日期： 2010－08－30; 修订日期： 2010－09－10

作者简介： 苏中静(1975－　)，湖北荆门市人，硕士，研究方向：肿瘤生物学。

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