李文丽/梁 欣#/张 伟/柏 桦/吴 昊/海春旭
(第四军医大学军事预防医学系毒理学教研室, 陕西 西安 710033)
Expression of apoptosis_related genes in mouse lungs induced by phosgene
LI Wen_li, LIANG Xin#, ZHANG Wei, BAI Hua, WU Hao, HAI Chun_xu
(Department of Toxicology, School of Military Preventive
Medicine, Fourth Military Medical University, Xi'an
710033, Shaanxi, China)
【摘要】 目的:研究光气染毒肺水肿小鼠肺组织Bax、c_Fos、c_Jun、Caspase_3 和Fas的表达。 方法: 10只BALB/c小鼠随机分为对照组和光气染毒组,每组5只。正常对照组以空气为对照,染毒组小鼠给予11.9 mg/L的光气,染毒时间为5 min。染毒后4 h,取小鼠肺脏,用4%的多聚甲醛固定。原位杂交和免疫组化测定肺组织Bax、c_Fos、c_Jun,Caspase_3 和Fas的表达。Westen blot 测定Fas蛋白的表达。 结果: 光气染毒组肺水肿小鼠肺组织Bax、c_Fos、c_Jun、Caspase_3和Fas基因的表达较对照组明显增高(P<0.05),且Fas蛋白的表达也升高(P<0.05)。 结论: 光气可能通过Fas/FasL通路诱导肺上皮细胞发生凋亡。
【关键词】 光气; 肺水肿; 凋亡; 氧化应激
中图分类号: R733.1 文献标识码: A 文章编号: 1004-616X(2010)-06-0436-05
【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To study the expressions of Bax, c_Fos, c_Jun, Caspase_3 and Fas in pulmonary edema induced by phosgene in mice. METHODS: 10 BALB/C mice were divided into control group and phosgene group with 5 mice in each. Mice were exposed to air and phosgene for 5 minutes in control and phosgene group, respectively. Dose of phosgene was 11.9 mg/L. After 4 hours' exposure, all mice were immediately anesthetized. Lungs were fixated by 4% citromint. The expressions of Bax, c_Fos, c_Jun, caspase_3 and Fas gene were determined by hybridization in situ and immunohistochemistry. We also tested the expression of Fas protein by Western blot. RESULTS: Expressions of Bax, c_Fos, c_Jun, caspase_3, Fas gene and Fas protein increased in pulmonary edema induced by phosgene in mice(P<0.05). CONCLUSION: Phosgene could cause induced apoptosis in pulmonary epithelia. It might be regulated by the Fas/FasL pathway.
【KEY WORDS】 phosgene; pulmonary edema; apoptosis;
光气是一种重要的化工原料,作为一种前体化合物广泛用于医药生产、染料、杀虫剂和制造海绵乳胶制品的聚亚胺酯等过程中。1990年数据汇编表明,仅美国每年就生产100万吨光气,据不完全估计,全球现存光气超过千余万吨,由于技术或操作等原因,光气或双光气等窒息性毒剂泄漏事故时有发生。光气中毒的特征性病理表现是肺水肿,引起肺水肿的原因有很多学说,其中之一是光气可诱导肺上皮细胞凋亡[1]。为进一步探讨凋亡相关基因对肺上皮细胞的调控作用,我们用免疫组化和原位杂交方法测定了光气致肺水肿小鼠肺脏的Bax、c_Fos、c_Jun、Caspase_3和Fas的表达,现报告如下。
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器
固体光气,润发化工有限公司产品;Fas、c_Fos、c_Jun、Caspase_3和Bax的检测试剂盒,由博士德生物公司提供;抗Fas抗体,Santa Cruz SC_716;抗β_actin抗体,Sigma AC_14;HRP标记的羊抗兔IgG,Santa Cruz公司;Portasens II气体检测仪,荷兰Analytical Technology公司;Leica Q570c真彩色图像分析仪,德国;Nikon Eclipse E1000 采图摄像系统,日本;微型蛋白质电泳和转移系统,美国Bio_Rad公司。
1.2 动物及分组
二级雄性BALB/c小鼠10只,体质量18~23 g, 由第四军医大学实验动物中心提供。随机分为2组:正常对照组和染毒组,每组5只动物。
1.3 染毒方法
正常对照组小鼠以空气为对照,染毒组小鼠给予11.9 mg/L剂量的光气,染毒时间为5 min。染毒后4 h用戊巴比妥钠麻醉小鼠,取肺脏,4%多聚甲醛固定。
1.4 凋亡相关因子的免疫组化和原位杂交检测
将4%多聚甲醛溶液固定的肺脏组织,常规脱水、包埋、切片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片、采图、图象分析。其中染色按照试剂盒说明书步骤操作。采图用日本Nikon Eclipse E1000 采图摄像系统。图象分析采用Leica Q570c真彩色图像分析仪进行阳性细胞平均灰度分析。
1.5 Western blot检测Fas蛋白
步骤简述如下。①组织裂解:取新鲜的小鼠肺组织,加入三去污裂解液裂解肺组织, 4 ℃ 12 000 r/min离心 10 min, 转移上清待测。②样品定量及处理:吸取2.0 μl裂解备用的蛋白样品,考马斯亮兰法测定样品中蛋白含量。分别适量吸取样品,按5∶1加入DTT, 补足去离子水,充分振荡,离心,煮沸5 min。③SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳:蛋白凝胶电泳装置中制备分离胶和浓缩胶,每孔加等量蛋白的上述样品,于恒流30 mA条件下电泳1.5 h。④转膜:以0.8 mA/cm2 NC膜面积,恒流下转移2 h,将凝胶中的蛋白转移至NC膜上。⑤丽春红染色:将NC膜浸入丽春红溶液进行染色,标记蛋白质分子量标准及各蛋白条带的位置。⑥封闭:将NC膜浸入10%的脱脂奶封闭液中,室温下封闭2 h。⑦抗体作用:将封闭好的NC膜加入稀释好的Fas和β_actin抗体,4 ℃过夜;然后弃去一抗,以TBST洗涤10 min×4次,再加入HRP标记的二抗,37 ℃温育1 h,弃去二抗,以TBST洗涤10 min×4次。⑧显色:将等体积的ECL液混合,加至NC膜上,在暗室内将X光片叠放在NC膜上置于暗盒内,曝光5 min后,将X光片显影、定影。
1.6 统计学方法
运用SPSS10.0统计软件处理数据,采用ANOVA检验,以α=0.05为检验水准。
2 结 果
小鼠肺细胞信号因子c_Fos主要在肺泡上皮表达,Fas、c_Jun、Bax、Caspase_3主要在血管内皮细胞表达(见图1~5箭头所示)。光气染毒组小鼠肺组织细胞因子的表达均较对照组增高,肺脏Fas蛋白表达较对照组增强,见表1及图1~6。
3 讨 论
在凋亡的分子生物学研究中发现,细胞凋亡与DNA上的一些基因作用有关,如Bax、c_Fos、c_Jun、Caspase_3、Fas等。为从基因水平探讨光气诱导小鼠肺组织细胞凋亡与肺水肿的关系,我们用免疫组化和原位杂交法测定了肺组织中以上几个基因的表达。在实验中所使用的光气剂量和染毒时间是我们前期实验得出的结果[2]。
Bax蛋白在细胞凋亡发生过程中,起重要枢纽作用。Caspase_3在细胞凋亡中是一个主要的效应型因子。Fujimura等[3]研究表明,脑缺血后细胞色素C的释放是Caspase_3激活的条件。光气是一种对肺组织损伤作用很强的化学物质[4-6]。我们的早期实验用基因芯片技术对光气染毒大鼠肺脏进行差异基因分析发现,光气可导致肺组织细胞色素C表达增强[7]。本实验中发现,光气染毒后肺组织Bax基因表达增强,提示光气所致细胞色素C表达可能是Bax基因变化的结果。本研究同时发现,光气中毒小鼠肺组织Caspase_3 mRNA表达增高。其原因可能是,光气作用于肺组织,使Bax蛋白增多,建立的线粒体膜通道增多,细胞色素C释放增加,激活了Caspase_3酶原,使Caspase_3活化,导致Caspase_3 mRNA表达增高。
王辉山等[8]的研究发现,c_Fos mRNA在兔体外循环模型表达明显增加。因此推测,兔体外循环模型c_fos mRNA表达的增高可能是肺在缺血再灌注后,内皮细胞、上皮细胞损害,引起Ca2+的改变,诱导了c_fos的表达。Ca2+是目前研究较多的c_Fos和c_Jun表达的诱导剂之一。Ca2+大量内流能明显地导致c_Fos和c_Jun大量表达。肺组织急性损伤时,兔肺上皮细胞、毛细血管内皮细胞质中c_Fos、c_Jun基因表达异常增多[9]。本实验结果表明,光气染毒后,小鼠AT_II内Ca2+浓度增加,肺存在自由基如ROS损伤,肺泡上皮c_Fos表达增加。因此,可以推测,光气肺损伤后,AT_II Ca2+内流诱导了c_Fos的表达,导致肺细胞凋亡,肺表面活性物质分泌减少,血管内皮细胞通透性增加,导致肺水肿发生。
目前已有研究证实与肺泡II型上皮细胞凋亡的相关基因主要有P53,Bcl家族和Fas系统,其中Fas/FasL系统是细胞凋亡的重要信号系统。近年来发现,Fas mRNA和蛋白可在肺泡II型上皮细胞上表达,且与这类细胞的凋亡相关。Fine等 [10]的研究结果表明,Fas基因可在大鼠AT_II表达,给予抗Fas抗体后,在体内、外均可导致细胞凋亡,提示Fas依赖的细胞凋亡参与肺泡上皮的更新和调控。肺急性损伤和呼吸窘迫综合征的患者肺水肿液和肺脏中Fas/FasL含量升高,肺泡上皮细胞出现凋亡征象。证明肺泡上皮细胞损伤与Fas/FasL系统上调和继发引起的肺泡腔上皮细胞和炎症细胞凋亡有关[11]。Fas/FasL系统是否对光气诱导的肺泡II型上皮细胞有调控作用,本课题对此进行了研究,其结果表明,光气染毒的肺水肿小鼠免疫组化结果显示血管内皮细胞表达Fas基因,Westen blot结果也证实光气染毒后Fas蛋白增加。Oshimi[12]证实Fas/FasL与相应单抗结合后,通过激活酸性磷脂酶并使细胞内Ca2+浓度升高从而诱导细胞凋亡。酸性鞘磷脂酶激活后,可以水解鞘磷脂产生神经酰胺,后者作为第二信使,可以激活膜结合性丝/苏蛋白激酶和胞浆内丝/苏蛋白激酶,这两种酶可以通过激活DG和三磷酸肌醇途径,使胞外Ca2+和内质网Ca2+快速流入胞浆,导致胞内Ca2+浓度升高,后者通过激活Ca2+依赖性核酸内切酶导致DNA损伤,从而引起细胞凋亡。因此,我们可以推论光气诱导小鼠肺脏细胞发生凋亡的通路为:Fas基因表达增加,导致胞内Ca2+浓度升高,后者通过激活Ca2+依赖性核酸内切酶导致DNA损伤,从而引起细胞凋亡。肺脏Fas蛋白上调对肺泡II型上皮细胞凋亡进行干预和调控将可能成为光气致肺水肿治疗的一条新途径。
参考文献
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收稿日期: 2010-08-25; 修订日期: 2010-09-27
基金项目: 军队十一五指令课题(06Z038)
作者简介: 李文丽(1969- ),女,内蒙古包头市人,博士,研究方向:军事毒理学。
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