陈进军1/赵　路2/董　玫3,/王思明4/秦琪瑜1/陈　虎1/史清文3,

(1. 河北医科大学第一医院肝胆外科，石家庄 050031； 2. 北京军区66010部队卫生队，石家庄 050061； 3. 河北医科大学基础医学院法医学系，河北省法医学重点实验室，石家庄 050017； 4. 河北医科大学药学院，石家庄 050017)

Anti_human hepatoma activity of five sesquiterpenoids from Inula helenium

CHEN Jin_jun1, ZHAO Lu2, DONG Mei3,, WANG Si_ming4, QIN Qi_yu1, CHEN Hu1, SHI Qing_wen3,

(1.The First Affiliated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031； 2. Beijing Military Command, No.66010 Health Team of PLA, Shijiazhuang 050061; 3. Department of Forensic Medicine, Hebei Medical University, Hebei Key Laboratory of Forensic Medicine, Shijiazhuang 050017; 4. School of Pharmaceutical Sciences, Hebei Medical University,

Shijiazhuang 050017, China)

　　【摘要】 目的： 检测菊科植物土木香中分离出的5种倍半萜类化合物对肝肿瘤活性的影响，探讨这5种倍半萜类化合物结构与活性之间的关系以及可能的作用机制。 方法： 利用噻唑蓝(MTT)比色法检测5种倍半萜类化合物对人肝肿瘤细胞增殖活性的影响；以移植性小鼠肝肿瘤H22为模型，检测异土木香内酯对昆明小鼠在体肿瘤生长以及机体免疫能力的影响；以体外培养的人胚肺成纤维细胞为模型，评价异土木香内酯对正常细胞的毒性。结果： 异土木香内酯对人肝肿瘤细胞(HLE)的增殖显示较强的抑制活性；其余4种化合物对HLE的增殖不显示抑制活性；异土木香内酯对小鼠移植性肝肿瘤H22体内生长具有较强的抑制活性，但对荷瘤小鼠胸腺指数和脾指数的影响与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)；异土木香内酯对体外培养的人胚肺成纤维细胞显示较弱的毒性。结论： 异土木香内酯具有较强的抗肝癌活性；其它4种倍半萜类化合物抑制活性的丧失可能是由于化合物中五元内酯环的环外双键饱和所致，或A、 B环的C5_C10键断开生成十元大环所致；增加机体免疫能力可能是异土木香内酯抗肝肿瘤的作用机制之一。

　　【关键词】 土木香； 倍半萜类化合物； 人肝肿瘤细胞； 增殖抑制活性； 构_效关系

　　中图分类号： R730.1　　　　文献标识码： A　　　　文章编号： 1004－616X(2010)06－0440－04

　　【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To assess the anti_human hepatoma effects of five sesquiterpene lactones from the roots of Inula helenium, and to explore the relationship between structure and activity and the possible mechanism of antitumor action. METHODS: Using MTT assay to evaluate the antitumor activities of five sesquiterpene lactones on the human hepatoma cell line HLE, and to explore the cytotoxicity on human embryonic lung cells. The rate of cell proliferation was determined by grafted tumor assay in vivo. RESULTS: Isoalantolactone exhibited significant anti_proliferative activities to hepatoma cell, while other compounds demonstrated weak anti_proliferative activities. Isoalantolactone significantly inhibited tumor growth of H22 tumor_bearing mice. Isoalantolactone showed no toxicity to human embryonic lung cell line in vitro. CONCLUSION: These results clearly demonstrated that the anti_tumor activities had close relationship with the structures, β_unsaturated five_membered lactone ring was necessary for the activities. When β_unsaturated five_membered lactone become saturated or the bond between C_5 and C_10 of ring_A and ring_B broken to form a 10_membered macroring, anti_proliferative activity was either diminished or lost.

　　【KEY WORDS】 inula helenium; sesquiterpenes; human hepatoma cell line; anti_proliferative activity; structure_activity relationship

　　土木香(inula helenium)系菊科旋覆花属植物，为多年生草本，是入药历史悠久、应用广泛的传统中药，具有健胃、利尿、祛痰和驱虫等功效[1]。研究表明土木香提取物土木香内酯类成分具有抗肿瘤、抗炎和抗真菌等多种生物活性[2－3]。本课题主要研究从土木香根中分离纯化的5种倍半萜内酯化合物对人肝肿瘤细胞增殖活性的影响，探讨了这5种倍半萜内酯化合物结构与活性之间的关系，为临床更好地开发利用土木香提供实验依据。

1　材料与方法

1.1　受试物

　　5种倍半萜类化合物：异土木香内酯 (isoalanto_ lactone)；2_羟基_11,13_二氢异土木香内酯(2_hydroxy_11,13_dihydroisoalantolactone)；11,13_二氢异土木香内酯(11,13_dihydroisoalantolactone)；3,9_二乙酰基，10_环氧_4(5)_吉玛烷_12,6α_交酯[3,9_diacetoxy1,10_epoxy,4(5)_germacraen_12,6a_olide]；3,9_二乙酰基，(10)_4(5)_吉玛烷_12,6α_交酯[3,9_diacetoxy1(10),4(5)_germacra_dien_ 12,6a_olide]等，均从土木香的根中分离得到，为白色针晶，经一维和二维核磁共振光谱(one_dimension and two_dimension nuclear magnetic resonance, NMR)和质谱确定它们的结构如图1所示，经高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)和1H_NMR检查，纯度在99％以上。

1.2　药品和试剂

　　噻唑蓝(MTT, Sigma)；RPMI 1640培养基 (Gibco)；顺铂 (Sigma)。

1.3　细胞系和实验动物

　　人肝肿瘤细胞株(HLE)由日本千叶大学医学部第二生物化学教室提供；人胚肺成纤维细胞 (HEL)由河北医科大学基础医学院细胞生物学实验室提供。各实验用细胞接种于直径为100 mm的培养皿中，加入含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基，37 ℃和5％CO2培养箱中培养。实验用小鼠为昆明小鼠，体质量18～22 g，合格证号：(冀)动字805213号。小鼠由河北医科大学实验动物中心提供，试验期间饲以该中心提供的饲料，自由饮水。

1.4　体外抑制细胞增殖实验

　　参照文献[4]中的方法。HLE细胞和HEL细胞接种于96孔板，每孔含1×104个细胞，分别加入溶剂对照(终浓度0.1％DMSO)，阳性对照顺铂和紫杉醇以及化合物1～5各受试物，终浓度均设为100、10和1 μmol/L 3个浓度组，每组设3个复孔，置于饱和湿度、37 ℃和5％CO2培养箱中培养48 h。于培养结束前4 h，各培养孔加入5 mg/ml MTT。实验终止时测定各孔吸光度值D(570)，并按下式计算细胞增殖抑制率。

　　细胞增殖抑制率(％)=[1－实验组D(570)值/对照组D(570)值]×100％

1.5　体内抑制肿瘤细胞增殖实验

　　参考文献[5]的方法，建立移植性肝癌H22小鼠模型。取小鼠腹腔传代的处于对数生长期的肝癌H22细胞，计数后用无菌生理盐水调整细胞浓度为5×107/ml，接种于小鼠右前肢腋窝皮下，每只0.2 ml，即1×107个细胞，接种1 d后，随机分为5组，每组10只。空白对照组按0.02 ml/g灌胃给予水；环磷酰胺组腹腔注射环磷酰胺[30 mg/(kg·d)]；给药实验组分为1、10和100 mg/(kg·d)3个剂量组，灌胃给予异土木香内酯(0.02 ml/g)，每日给药1 次，连续10 d。第10天处死小鼠，迅速剥取瘤块、胸腺和脾脏，称取瘤质量、胸腺和脾质量，按下式计算肿瘤抑制率、胸腺指数和脾指数。

　　肿瘤抑制率(％)=(1－给药组平均瘤质量/对照组平均瘤质量)×100％

　　胸腺(脾)指数=1 000×胸腺(脾)质量/体质量

1.6　统计学处理

　　数据用－±s表示；两组间均数的比较用t检验，多组间均数的比较用单因素方差分析。应用SAS6.12统计软件计算。

2　结　果

2.1　化合物1～5对体外培养的HLE细胞增殖的抑制作用　

　　结果如图2所示，100 μmol/L阳性对照紫杉醇及化合物1对HLE细胞的增殖显示较强的抑制活性，其细胞增殖抑制率分别为73.18％和64.14％(图2A)，并且与溶剂对照组相比较差异有统计学意义(P<0.01)。紫杉醇及化合物1对HLE细胞增殖的半数抑制浓度(IC50)分别为4.03 μmol/L和19.41 μmol/L，而阳性对照顺铂对HLE的增殖显示较弱的抑制活性，其IC50大于100 μmol/L(图2B)，提示异土木香内酯有较强的抑制HLE细胞增殖的作用；而与化合物1结构相似的化合物2、3和A、B环变成十元大环的化合物4、5即使用100 μmol/L处理HLE细胞，对其增殖均显示弱的抑制活性，细胞增殖抑制率分别为22.45％、11.89％、9.14％和11.07％(图2A)。

2.2　异土木香内酯对体外培养的HEL细胞增殖的抑制活性的影响

　　实验结果如图3所示，阳性对照顺铂对HEL细胞的增殖呈现较强的抑制活性，IC50为26.69 μmol/L，而异土木香内酯在100 μmol/L剂量组显示较低的细胞抑制活性，其细胞增殖抑制率为22.37％，IC50大于100 μmol/L。

2.3　异土木香内酯对小鼠移植性肿瘤H22增长的抑制作用 

　　实验结果如图4所示，腹腔给予环磷酰胺，显著地抑制小鼠肝癌H22的生长，肿瘤抑制率为67.56％，异土木香内酯连续给药10 d，100和10 mg/(kg·d)剂量组可显著抑制小鼠肝癌H22的生长，肿瘤抑制率为65.50％和42.97％，与空白对照组比较差异有统计学意义 (P<0.01)(图4A)。环磷酰胺组比对照组的胸腺指数和脾指数显著降低 (P<0.01)，但化合物1各剂量组的胸腺指数以及脾指数与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)(图4B)。

3　讨　论

　　肝癌是人类最常见的恶性肿瘤之一, 目前外科手术治疗仍是肝癌治疗的首选方案, 但是95％的肝癌患者在确诊时已失去手术机会, 只能依赖于化学药物的治疗, 但是由于肝癌属于化疗不敏感的恶性肿瘤, 大多数的化疗药物并不能提高肝癌患者的生存质量[6]。寻找高效低毒的新的抗癌成分一直是药物学家和肿瘤专家努力的方向[7－8], 因此，新的肿瘤治疗药物的研制已经成为十分迫切的医学与社会问题。

　　我们以前的系列研究发现，土木香中提取的多种倍半萜类化合物对恶性肿瘤细胞显示出较强的抗增殖活性[9－10]，本实验中，我们采用土木香根中提取的5种倍半萜内酯化合物，研究其对人肝肿瘤细胞增殖的抑制活性。

　　结果显示，异土木香内酯对人肝肿瘤细胞的增殖有明显的抑制作用，并且呈现较好的剂量依赖关系；进一步的在体实验表明，异土木香内酯对小鼠移植性肿瘤H22生长具有抑制作用，并且不降低荷瘤小鼠的胸腺指数和脾指数，推测异土木香内酯有可能是提高机体的免疫能力来实现其抗肿瘤活性的。有关作用机制的实验正在进一步研究中。同样从土木香根中提取得到的2_羟基_11,13_二氢异土木香内酯，11,13_二氢异土木香内酯，3,9_二乙酰基，10_环氧_4(5)_吉玛烷_12,6α_交酯和3,9_二乙酰基，(10)_4(5)_吉玛烷_12,6α_交酯 ，即使用100 μmol/L的浓度处理HLE肿瘤细胞，对其增殖均显示较弱的抑制活性。从结构上分析异土木香内酯属于桉叶烷型(eudesmane)倍半萜内酯，其活性与其具有的α,β_不饱和五元内酯环的结构有关，抑制活性的丧失可能是由于化合物2、3中五元内酯环的环外双键饱和所致；而化合物4和5属于吉玛烷型(germacrane)倍半萜内酯，A_，B_环的C5_C10键断开生成十元大环可能是其活性消失或减弱的原因。

　　我们通过对土木香中提取的5种倍半萜内酯化合物对人肝肿瘤细胞的增殖抑制活性筛选的研究，探讨化合物构_效关系，并将在下一步对土木香提取的异土木香内酯的抑制人肝肿瘤细胞增殖机制进行深入研究，为临床更好地开发利用土木香提供实验依据。

参考文献

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[4] 司徒镇强. 细胞培养 [M]. 北京: 世界图书出版社, 1996:134－138.

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[6] Thomas M. Molecular targeted therapy for hepatocellular carcinoma [J]. J Gastroenterol, 2009,19:136－141.

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[8] Newman DJ, Gragg GM, Snader KM. Natural products as sources of new drugs over the periods 1981－2002[J]. J Natural Products, 2003,66:1022－1037.

[9] 司亚茹，李珊珊，姜　霞，等.3种倍半萜化合物抑制妇科肿瘤细胞增殖活性及其作用机制探讨[J]. 癌变·畸变·突变， 2010,22(1):28－31.

[10] 李　勇，李铁库，温士旺，等. 土木香中纯化的五种倍半萜化合物抑制肿瘤增殖活性的研究[J]. 中国药理学通报, 2010,26(1):112－115.

收稿日期： 2010－05－31； 修订日期： 2010－10－06

基金项目： 国家自然科学基金(8107255)，河北省自然科学基金(08B032，C2010000489)，河北省留学回国人员科技活动项目(2006－02)

作者简介： 陈进军(1960－　)，男，河北人，硕士，主任医师，研究方向：肝脏恶性肿瘤的基础与临床。

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