周焕发1/赵红斌1/杨银书2/程谋涛1/刘旭东1

(1． 兰州军区总医院，甘肃 兰州 730050； 2． 兰州军区疾病预防控制中心, 甘肃

兰州　730020)

Effects of polychlorinated biphenyl on c_fos, c_Myc and β_catenin expressions in rat kidneys

ZHOU Huan_fa1,  ZHAO Hong_bin1, YANG Yin_shu2, CHENG Mou_tao1, LIU Xu_dong1

(1. General Hospital of Lanzhou Military Command, Lanzhou 730050, Gansu; 2. Lanzhou Command Center for Disease Prevention and Control, Lanzhou 730020, Gansu, China)

　　【摘要】 目的： 探讨多氯联苯(polychlorinated biphenyl, PCB) 对大鼠肾脏组织c_fos、c_Myc和β_catenin表达的影响。方法: Wistar大鼠45只随机分为4组, 对照组饲喂正常饲料，PCB低、中、高剂量组分别饲喂不同PCB含量(分别为0.1、1、10 mg/kg)的颗粒饲料，90 d后建立慢性PCB毒性动物模型，利用免疫组化方法检测PCB染毒后大鼠肾脏组织中c_fos、c_Myc和β_catenin蛋白的表达。结果: 对照组肾小管上皮细胞中c_fos和c_Myc为阴性，低、中、高PCB剂量组c_fos表达的阳性率分别为58.33％、100％和75.3％，中剂量组阳性率同其它各组相比差异具有统计学意义(P<0.01)；低、中、高PCB剂量组c_Myc表达的阳性率分别为41.67％、75％和100％，高剂量组c_Myc的阳性表达率显著高于其它各组(P<0.01)；低、中、高PCB剂量组β_catenin表达的阳性率分别为91.6％、100％和83.3％,明显高于对照组22％(P<0.01)，PCB各组β_catenin阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。 结论： PCB能促进大鼠肾脏组织表达c_fos、c_Myc和β_catenin，并可能与PCB对肾脏功能的损伤有关。

　　【关键词】 多氯联苯; 大鼠肾脏; c_fos; c_Myc; β_catenin

　　中图分类号： R741　　　　文献标识码： A　　　　文章编号： 1004－616X(2010)06－0448－04

　　【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To study the effects of polychlorinated biphenyl(PCB) on c_fos,c_Myc and β_catenin expressions in rat kidneys. METHODS: 45 Wistar rats were divided into a control and three experimental groups (fed with 0.1 mg/kg, 1 mg/kg and 10 mg/kg of PCB) for 90 days. Immunohistochemical assay was performed to study the expressions of c_fos,c_Myc and β_catenin in rat kidney tissues. RESULTS: The expressions of c_fos and c_Myc in renal tubular epithelial cells were negative in control group, the positive ratios of c_fos were 58.33％,100％ and 75.3％, respectively, in the experimental groups, the positive ratio was significantly higher in 0.1 mg/kg group than that in the other groups(P<0.01). The positive ratios of c_Myc were 41.67％, 75％ and 100％, respectively, in the experimental groups. In the 10 mg/kg PCB group, the expression of c_Myc was markedly higher compared with other groups(P<0.01).  The positive ratios of β_catenin in the three experimental groups were much higher than that in control group(P<0.01), but were not significantly different among the experimental groups(P>0.01). CONCLUSION: PCB could induce the expressions of c_fos, c_Myc and β_catenin in rat kidney tissues, and caused marked functional injuries of rat kidneys.

　　【KEY WORDS】 polychlorinated biphenyls; rats kidney; c_fos; c_Myc; β_catenin

　　多氯联苯(polychlorinated biphenyl，PCB)是存在于环境中的类激素化合物，对人体产生严重的毒害作用。笔者前期的研究表明，PCB对大鼠肾脏组织具有明显的损伤作用。此外，PCB能影响肾脏组织转化生长因子β(transforming growth factor β, TGF_β)和Bcl_2的表达[1]。为了进一步探讨PCB对肾脏功能影响的机制，本研究探讨PCB对凋亡相关蛋白c_fos、c_Myc和β_catenin的影响。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　主要试剂　50 mg纯品PCB(Sigma公司)溶于100 ml玉米油中，与饲料混合后配制成不同PCB含量的颗粒饲料(分别为0.1、1、10 mg/kg )；c_fos、c_Myc一抗和免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物公司；β_catenin一抗购自Sigma公司。

1.1.2　动物　清洁级Wistar大鼠45只，雌雄各半，体质量(50±10)g(兰州医学院动物中心)。实验动物合格证号：甘医动字960017号；动物实验环境合格证号：军医动字第C08005号。

1.2　方法

1.2.1　动物分组及模型制备　45只大鼠随机分为4组，其中对照组为9只，3个染毒组各为12只。对照组饲喂正常饲料，低、中、高剂量组分别饲喂不同PCB含量(分别为0.1、1、10 mg/kg)的颗粒饲料，每组每天定量添加相同量的鼠料和饮水，标准环境下饲养90 d。

1.2.2　免疫组化染色　90 d 后处死动物，剖腹分离左右肾脏，纵切后置10％福尔马林中常温固定24 h，常规切片、脱蜡。切片置0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液中，微波加热3次，每次15 min进行抗原修复。3％ H2O2 室温孵育10 min以去除内源性过氧化物酶；0.01％TritonX_100室温渗透10 min以增加组织细胞的通透性；正常山羊血清室温孵育20 min封闭非特异性抗原；分别加c_fos(1∶200)、c_Myc(1∶200)和β_catenin(1∶4 000) 一抗4 ℃过液；加羊抗兔生物素化IgG 37 ℃ 20 min；加SABC 37 ℃、 20 min。DAB 显色5～10 min，蒸馏水充分冲洗，苏木精轻度复染、脱水、封片，观察并拍照。

1.2.3　结果判断　c_fos以肾小管上皮细胞核呈棕黄色者为阳性；c_Myc和β_catenin以肾小管上皮细胞浆呈棕黄色者为阳性。随机选择5个高倍视野(×400)进行观察计数，阳性率(阳性细胞数/观察的总细胞数)>50％～100％为强阳性，≥10％～50％为阳性表达，<10％为阴性。

1.2.4　统计学方法　采用SPSS13.0统计软件对各组间相关数据进行χ2检验。

2　结　果

2.1　PCB对大鼠肾脏c_fos表达的影响

　　结果见表1。对照组肾脏组织c_fos为阴性(图1A)；低剂量组c_fos分布于肾小管上皮细胞胞浆(图1B)，阳性率为58.33％；中剂量组c_fos主要定位于胞核，胞浆中可见少量表达(图1C)，阳性率为100％ ；高剂量组c_fos阳性率为75.3％(图1D)。实验各组c_fos阳性率与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.01)；中剂量组c_fos阳性率与低剂量组和高剂量组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2　PCB对大鼠肾脏c_Myc表达的影响

　　c_Myc定位于肾小管上皮细胞胞浆，对照组c_Myc为阴性(图2A)；低剂量组c_Myc的阳性率为41.67％(图2B)；中剂量组c_Myc表达的阳性率为75％(图2C)；高剂量组c_Myc表达的阳性率为100％(图2D)。高剂量组c_Myc阳性率与其它各组比较差异具有统计学意义(P<0.01)；中剂量组c_Myc阳性率与低剂量组和对照组相比差异也具有统计学意义(P<0.05)，结果见表2。

2.3　PCB对大鼠肾脏β_catenin表达的影响　

　　β_catenin定位于胞浆和胞核。对照组肾脏组织β_catenin表达的阳性率仅为22％(图3A)；低剂量组和中剂量组β_catenin表达的阳性率分别为91.6％和100％，主要分布于胞浆(图3B，3C)；高剂量组β_catenin阳性率为83.3％，胞核可见β_catenin表达(图3D)。PCB组β_catenin阳性率与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.01)，结果见表3。

3　讨　论

　　PCB是一类广泛存在于环境中的化合物，具有强烈的致癌作用，能使机体的各种凋亡基因异常表达，促进细胞凋亡，并产生严重的毒害[2]。

　　c_fos基因为一快速的早期反应基因，能对外界刺激在数十分钟内作出反应。c_fos基因被激活转录后形成c_fos mRNA。c_fos再由胞浆转入核内与Jun等核蛋白结合形成复合物，并通过选择性启动子刺激目的基因而转录[3]。c_fos蛋白的异常表达是引起细胞发生凋亡的重要因素之一。本研究结果显示，PCB能诱导肾组织细胞表达c_fos蛋白，低水平的PCB主要使c_fos蛋白聚集于细胞浆；随着PCB水平增加，c_fos蛋白快速聚集于细胞核，启动目的基因的表达，促使肾小球和肾小管上皮细胞凋亡；高水平的PCB使肾组织细胞 c_fos蛋白的表达降低，这可能由于细胞已发生凋亡使c_fos蛋白表达迅速下降所致。由此可见，PCB对肾脏的损伤与c_fos异常表达有密切关系，这同笔者以前关于PCB对肝脏损伤的研究报道相符[4]。

　　c_Myc癌基因属核蛋白基因，具有转化细胞的能力，在调节细胞生长、分化及恶性转化中发挥作用。c_Myc蛋白参与诱导细胞凋亡。c_Myc基因表达的失调是多种细胞凋亡的主要诱因，细胞发生凋亡的速度及其对诱导因素的敏感性均依赖于细胞c_Myc蛋白的含量[5]。本研究发现PCB对c_Myc蛋白表达的影响具有剂量相关性，高水平PCB能使肾脏组织c_Myc蛋白的表达显著增加，c_Myc蛋白的高表达加速肾组织细胞的凋亡，促使肾脏功能的损伤。

　　β_catenin是Wnt信号通路的关键分子，在传导Wnt信号中发挥重要的作用。当细胞内游离β_catenin聚集后，β_catenin进入细胞核与T细胞因子(T cell factor, Tcf)/白细胞增强因子(lymphocyte enhancer factor, Lef)结合，促进靶基因的转录(如c_Myc) [6]。大量研究表明，β_catenin作为Wnt/β_catenin信号通路的关键成员在介导信号转导过程中调控细胞的增殖和凋亡。β_catenin在生理状态下参与肾小管上皮细胞间的连接，当上皮细胞间的黏附完整性受损时，它被释放出来,参与信号转导。Simecková P等[7]研究报道PCB通过影响细胞内黏附分子的功能对细胞产生毒性作用。本研究结果证实，PCB能促进肾小球和肾小管上皮细胞持续表达β_catenin蛋白，β_catenin蛋白表达的阳性率明显高于对照组，提示PCB促使β_catenin在细胞浆的聚集以及胞核中的定位，能有效激活c_Myc蛋白的表达，进而引起细胞的凋亡，这与PCB能促进c_Myc蛋白表达的结果一致，表明PCB对肾组织的损伤可能与β_catenin信号途径有密切关系。

　　综上所述，PCB对肾脏功能的损伤可能是通过影响c_fos、c_Myc和β_catenin蛋白的表达实现的，细胞凋亡相关蛋白的异常表达促进了肾组织细胞的凋亡。这些研究结果对进一步认识PCB等环境类激素化合物对机体产生的影响，具有重要的理论意义。

参考文献

[1] 杨银书,赵红斌,李天真,等.多氯联苯对大鼠肾脏bcl_2及TGF_β1表达影响的研究[J]. 中国比较医学杂志,2005,15(3):133－135.

[2] Kietz S, Fischer B. Polychlorinated biphenyls affect gene expression in the rabbit preimplantation embryo[J]. Mol Reprod Dev,2003,64(3):251－260.

[3] Chen YG, Lui HM, Bin SL, et al. Regulation of cell proliferation ,apoptosis and carcinogenesis by activin[J]. Exp Biol Med, 2002, 227(2):75－87.

[4] 史智勇, 董菊子,马　慧,等. 多氯联苯对大鼠肝脏结构及功能的影响[J]. 癌变·畸变·突变,2008,20(3):224－226.

[5] 白　阳,叶　健,王敬泽. c_Myc功能及其下游靶点[J]. 细胞生物学杂志, 2007, 29(2): 191－196.

[6] Maiese K, Li Faqi, Zhao ZC, et al. The Wnt signaling pathway: aging gracefully as a protectionist?[J]. Pharmacol Ther, 2008,118 (1) :58－81.

[7] Simecková P, Vondrácek J, Procházková J, et al. 2,2',4,4',5,5'_hexachlorobiphenyl (PCB 153) induces degradation of adherens junction proteins and inhibits beta_catenin_dependent  transcription in liver epithelial cells[J]. Toxicology, 2009，260(1/2/3):104－111.

收稿日期： 2010－03－30； 修订日期： 2010－07－12

基金项目： 甘肃省自然科学基金资助项目(ZR297089)

作者简介： 周焕发(1958－　)，男，陕西商洛人，副主任医师，研究方向：预防医学与保健。

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