王　典1,2/康祥锦1/谢庆东1/黄天华1,

(1. 汕头大学医学院生殖医学研究中心； 2. 汕头大学医学院法医学教研室,  广东

汕头 515041)

The expression of human immunodeficiency virus _1 gag gene in mature human spermatozoa

WANG Dian1,2, KANG Xiang_jin1,  XIE Qing_dong1, HUANG Tian_hua1,

(1. Research Center for Reproductive Medicine; 2. Forensic Medicine Department, Shantou University Medical College, Shantou 515041,Guangdong, China)

　　【摘要】 目的: 探讨人免疫缺陷病毒_1(HIV_1) gag基因在人成熟精子中实现mRNA水平表达的可能性。 方法: 构建含HIV_1 gag 基因DNA的质粒，转染入人成熟精子，培养24 h后用RT_PCR法检测精子gag mRNA的表达。 结果: 在转染质粒后的人成熟精子中检测到HIV_1 gag mRNA的表达。 结论： HIV基因可在人成熟精子中实现mRNA水平的表达。

　　【关键词】 人免疫缺陷病毒_1； 人成熟精子； mRNA

　　中图分类号： R511　　　　文献标识码： A　　　　文章编号： 1004－616X(2010)06－0455－04

　　【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To explore the possibility of HIV gag gene mRNA expression in mature human spermatozoa. METHODS: Plasmid containing HIV gag DNA were constructed, and then transfected into the mature human spermatozoa. After 24 h culture, HIV gag mRNA was detected by RT_PCR.  RESULTS: HIV gag mRNA could be detected in transfected mature human spermatozoa. CONCLUSION: HIV gag gene could be expressed at mRNA level in mature human spermatozoa. 

　　【KEY WORDS】 human immunodeficiency virus_1； mature human spermatozoa；mRNA

　　前期研究已证实AIDS患者精子可被人免疫缺陷病毒_1(human immunodeficiency virus _1,HIV_1)感染，在体外HIV_1也可感染人成熟精子[1－2]，但HIV_1在其中能否实现mRNA水平的表达尚不清楚，然而这却是事关HIV_1能否在精子中完成生命周期的重要问题。前期研究可在患者精子中检测到HIV_1 RNA，但并不能明确区分该RNA是感染入精子的原始RNA核酸还是新转录mRNA[3]。为了探讨这个问题，本研究首先从来源于HIV_1的慢病毒质粒ΔNRF 中克隆出对HIV_1的致病具有重要作用的gag基因，并构建pIRES2_EGFP_gag质粒，将该质粒转染入人成熟精子，检测其中的HIV_1 gag mRNA，以探讨HIV_1感染人成熟精子后实现mRNA水平表达的可能性。

1　材料与方法

1.1　pIRES2_EGFP_gag质粒构建及鉴定

　　以慢病毒载体中的ΔNRF质粒(徐州医学院徐开林教授惠赠)作为模板，用下列引物扩增gag序列：正向5′_CCGGAATTCATGGGTGCGAGAGCGTC_3′，包含EcoRI酶切位点(划横线部分)；反向5′_CGCGGATCCTTATTG TGACGAGGGGTCG_3′，包含 BamHI 酶切位点(划横线部分)。扩增条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃30 s、64 ℃ 40 s、72 ℃1 min,35个循环；72 ℃延伸5 min。扩增产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳。在紫外灯下将含有产物的凝胶切下，用DNA纯化试剂盒(Qiagen，德国)提取、纯化DNA。pIRES2_EGFP(美国宾夕法尼亚州大学鲁凤民教授惠赠)质粒用EcoRI与BamHI 在37 ℃下作用1 h进行酶切。纯化的DNA与质粒的酶切产物用T4连接酶4 ℃连接过夜。将适量连接产物(<10 μl)加至200 μl大肠杆菌感受态细胞中转化后，用质粒提取试剂盒(Tiangen，中国)提取DNA。将所提取的质粒DNA及上述引物送上海基康公司测序加以鉴定。

1.2　精子的收集

　　2名成年男性参与本实验，禁欲3 d后，手淫法取精液标本，置于37 ℃培养箱中充分液化。上游法收集高活力精子，步骤如下：准备5～7个短试管(14 mm×50 mm), 每管加入1.5～2.0 ml BWW(含0.3％ BSA)培养基，预热至37 ℃。将液化精液小心加入管底，每管0.1～0.2 ml，试管直立置于37 ℃培养箱中1 h。收集上层含高活力精子的培养基。600 g离心5 min，再用BWW培养基离心洗涤3次。

1.3　质粒转染人成熟精子

　　无菌条件下，在PCR反应管中加入22 μl Hepes_buffered saline (HBS) 缓冲液(包括 20 mmol/L Hepes,150 mmol/L NaCl, pH=7.4)和3 μl脂质体DOSPER至25 μl配制成A液，在另一管中加入含1.5 μg pIRES2_EGFP_gag质粒并加适量 HBS缓冲液至总体积25 μl，配制成B液。按1∶1混匀A液和B液(总体积为50 μl)，在室温下孵育15 min以形成脂质体_DNA复合物。然后将包裹好的质粒溶液加入精子悬液中，混匀，在37 ℃、5％ CO2培养箱中培养24 h。

1.4　精子中HIV_1 gag DNA的检测

　　精子基因组DNA提取的具体步骤如下：①精子样本离心洗涤6次后，小心吸去上清，在离心管内留置0.2 ml精子沉淀；②加入500 μl BufferⅠ(150 mmol/L NaCl, 10 mmol/L EDTA，pH=8.0), 30 μl BufferⅡ(100 mmol/L Tris·HCl，pH= 8.0，10 mmol/L EDTA，500 mmol/L NaCl，1％ SDS，2％ β_巯基乙醇), 15 μl 蛋白酶K(250 μg/ml), 12 μl二巯基苏糖醇(DTT，40 mmol/L)； ③55 ℃摇床过夜后，于4 ℃、16 000 g离心5 min(下同)；④取上清液，加入等体积的Buffer III(V酚∶V氯仿=1∶1)，离心，取上清，重复此步骤1次；⑤加入等体积的Buffer IV(V酚仿∶V异丙醇=24∶1)，离心，取上清；⑥ 加入2倍体积的预冷无水乙醇，－20 ℃沉淀2 h；⑦70％乙醇洗涤，室温放置1 h；溶解于30～50 μl ddH2O，－20 ℃冰箱保存。

　　取适量提取的精子DNA作为模板，以与1.1相同的扩增条件与引物进行PCR扩增。

1.5　精子中HIV_1 gag mRNA的检测

　　精子RNA提取的步骤如下：① 精子样本洗涤6次后小心吸去上清，调整精子细胞浓度至1×107/ml，加入1 ml Trizol颠倒混匀，室温下作用5 min；②加1/5体积(0.2 ml)的氯仿，颠倒混匀，室温下作用5 min，后于4 ℃、16 000 g离心15 min；③将上层水相吸至另一EP管中；④加等体积异丙醇，混匀后置－20 ℃中1 h，再于4 ℃、16 000 g离心10 min，弃上清；⑤加冰预冷的75％乙醇(DEPC水配制)1 ml并于4 ℃、16 000 g离心5 min，弃上清，干燥；⑥用20 μl DEPC水溶解沉淀，立即用于RT_PCR或保存于－70 ℃冰箱。

　　RT_PCR简要步骤如下：加入3 μl DNase I，置于PCR仪内，37 ℃作用30 min消化基因组DNA；冰上8～10 min后，于75 ℃作用5 min灭活DNase I。然后按照TaKaRa公司提供的逆转录反应试剂盒说明书进行逆转录，并以与1.1相同的扩增条件及引物进行PCR扩增。

2　结　果

2.1　构建质粒的鉴定

　　重组质粒pIRES2_EGFP_gag结构如图1所示。酶切鉴定结果见图2，重组质粒用EcoRI和BamHI酶切得到1 503 bp和5 276 bp的两段序列；用EcoRI酶切得到6 779 bp的1段序列。PCR鉴定结果见图3，用上述引物可在重组质粒扩增出1 512的阳性带。测序结果也进一步证实pIRES2_EGFP_gag重组质粒构建成功。

2.2　精子中gag DNA检测结果

　　质粒pIRES2_EGFP_gag转染精子，培养24 h后，充分洗涤，提取其基因组，用上述引物扩增gag基因，产物在1.2％的琼脂糖凝胶中电泳，发现转染精子和阳性对照泳道均有1 521 bp的特异条带，而精子洗涤液(阴性对照)未见条带(图4)。

2.3　精子中gag基因的转录

　　人成熟精子转染pIRES2_EGFP_gag质粒24 h 后，提取总RNA，进行RT_PCR。在待测样本可扩增出1 521 bp 的片段， 提示转染精子存在HIV_1 gag mRNA。HIV_1 gag cDNA已在精子中成功转录(图5)。

3　讨　论

　　性途径是HIV_1传播的主要途径，其中精液是最主要的媒介。精子是精液中的主要成分，精子能否参与HIV_1的传播过程是一个重要的问题，这取决于HIV_1能否在精子中完成生命周期，包括病毒逆转录、整合、复制、转录、组装等过程[4－5]。前期研究发现HIV_1在体内外均可感染人成熟精子，并在其中检测到HIV_1 RNA[1]。但目前仍不清楚是否为HIV_1新转录的mRNA。而实现mRNA水平中的表达是HIV_1感染宿主后完成生命周期的重要一步。

　　本研究选择对HIV_1的致病具有重要作用的gag基因进行研究。首先成功构建了含HIV_1 gag cDNA的pIRES2_EGFP_gag质粒，然后转染人成熟精子，发现质粒可成功转染入精子，培养24 h后可在其中检测到HIV_1 gag的mRNA，表明HIV_1感染人成熟精子后，其基因可在其中转录。本结果为病毒本身在成熟精子中实现在mRNA水平的表达提供了依据。

　　人成熟精子是特殊的终末分化的生殖细胞，其染色体高度浓缩、凝聚。为适应快速运动与穿卵的需求，在其成熟阶段，去掉了大部分胞浆及细胞器，因而多数基因在精子中表达受限[6]。那么HIV_1有无可能在成熟精子中表达，如果可以，其机制是什么？本结果表明HIV_1基因可在人成熟精子中转录。与此相符的是，本课题组前期研究发现，HBV病毒可以整合入患者人成熟精子染色体中[7]。业已证实哺乳动物成熟精子具有非特异性吸收外源DNA或RNA片段的功能，而且外源RNA还可被成熟精子中固有的逆转录酶逆转录成cDNA并整合入精子基因组[8]。这些信息为病毒在精子中转录提供了依据，表明HIV_1基因在成熟精子中转录、表达是通过对其整合来实现的。

参考文献

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收稿日期： 2010－09－07； 修订日期： 2010－09－21

基金项目： 国家自然科学基金资助项目(30800940)

作者简介： 王　典(1978－　)，男，汉族，广东河源人，医学博士，助理研究员，研究方向：分子遗传学。

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