梅树江1/刘　娅2，/王宝贵2/张桂英2/章培标3/赵林伊2

(1.深圳市疾病预防控制中心，广东 深圳 518055； 2.吉林大学公共卫生学院，吉林 长春 130021； 3.中国科学院长春应用化学研究所，吉林 长春 130022)

The toxicological effects of polyoxometalates α_Ti3

MEI Shu_jiang1, LIU Ya2，, WANG Bao_gui2， ZHANG Gui_ying2， ZHANG Pei_biao3，ZHAO Lin_yi2

(1. Shenzhen Center for Disease Control and Prevention,Shenzhen 518020, Guangdong； 2. Public Health College of Jilin University, Changchun 130021； 3. Changchun Institute of Applied Chemistry,Chinese Academy of

Sciences，Changchun 130022,Jilin, China)

　　【摘要】 目的： 对杂多化合物九钨三钛硅酸盐(α_K8H2[SiW9Ti3O40]·15H2O，α_Ti3)的毒性进行研究，为其临床应用提供科学依据。 方法： 采用小鼠经口急性毒性试验、蓄积毒性试验、Ames试验、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)染色体畸变试验和细胞毒性试验对α_Ti3毒性进行检测。 结果： 小鼠经口急性毒性试验的半数致死剂量(LD50)为2 055.36 mg/kg，属低毒物质；蓄积毒性试验提示α_Ti3在体内蓄积系数K>5，为轻度蓄积；Ames试验在每皿31.3～500 μg浓度范围内，无论加S9与否，每皿菌落回变数均未超过阴性对照组的两倍；中国仓鼠卵巢细胞染色体畸变试验在40～320 μg/ml范围内，无论加S9与否，CHO染色体畸变率与阴性对照组比较均无明显增加。对大鼠外周血细胞毒性和骨髓细胞毒性的半数抑制浓度(IC50)分别为0.135、0.223 mg/ml，高于S180腹水瘤细胞和小鼠肝癌细胞，说明该药对正常细胞的毒性作用较低。结论： 在本实验条件下，杂多化合物九钨三钛硅酸盐属低毒物质，提示其具有良好的应用前景。

　　【关键词】 杂多化合物； 急性毒性； 蓄积毒性； 致突变试验； 细胞毒性

　　中图分类号： R979.1；R994　　　　文献标识码： A　　　　文章编号： 1004－616X(2010)06－0465－04

　　【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To investigate the toxicity of polyoxometalates α_K8H2[SiW9Ti3O40]·15H2O(α_Ti3) for clinic application. METHODS: The studies were conducted with acute toxicity test, cumulative toxicity test, Ames test and chromosome aberration test on CHO cell in vitro and cytotoxicity test. RESULTS: LD50 in mice was 2 055.36 mg/kg, α_Ti3 was a low_grade toxicity compound. The cumulation coefficient was exceed 5, it showed α_Ti3 was low cumulation. The results of Ames test showed no mutagenic effects with the concentration ranged from 31.3 to 500 μg/utensil with or without S9 mixture added. The chromosome aberration ratio of α_Ti3 groups was no significant discrepancy compared with the control on CHO cells,with the concentration ranged from 40 to 320 μg/ml with or without S9 mixture added. IC50 of medulla cells and peripheral blood lymphocytes of rats in vitro treated with α_Ti3 were 0.223 and 0.135 mg/ml,respectively. However,IC50 of S180 ascites tumor cell and mice hepatoma carcinoma cell were low. It showed the toxicity of α_Ti3 was low on normal cell. CONCLUSION: The toxicity of α_Ti3 was low and no mutagenicity was observed in this experiment,the results suggested that α_Ti3 should be a better anti_tumor drug in clinic chemical theropy.

　　【KEY WORDS】 polyoxometalates； acute toxicity； cumulative toxicity；mutagenicity test； cytotoxicity

　　杂多化合物(polyoxometalates,POMs)是杂多酸及其盐的总称。杂多酸是指一类含有氧桥的多核混合价态配合物，具有类似于分子筛的笼状结构特征[1]。随着杂多化合物的结构和性质的不断深入研究，其潜在的抗病毒、抗肿瘤活性也日益为人们所重视[2]。近年来对新型杂多化合物抗流感病毒、禽流感病毒以及对乙肝病毒复制的抑制作用均有一定研究[3－5]。    

　　刘景福等[6]合成的α和β_Ti3取代的Keggin型含氧钨酸盐——九钨三钛硅酸盐α_K8H2[SiW9Ti3O40]·15H2O(α_Ti3)具有独特的光催化活性和抗病毒活性。我们以往的研究结果，显示该化合物在抗肿瘤领域还具有广阔前景。但α_Ti3的毒性作用目前还不清楚，故本文对其急性毒性、蓄积毒性、致突变性和细胞毒性进行了研究，以期为α_Ti3的临床应用提供科学依据。

1　材料与方法

1.1　主要材料

　　α_Ti3由东北师范大学化学系合成，为白色针状结晶体。自制的大鼠肝微粒体体外活化系统S9，制备后贮存于－80 ℃低温冰箱。中国仓鼠卵巢细胞(CHO)由北京医科大学提供。组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100和TA102，由吉林大学公共卫生学院毒理教研室提供，各试验菌株经his、UVrB、rfa、R因子、PAQl质粒、自发回变等6项性状鉴定合格后用于试验。

1.2　急性毒性试验

　　采用改良寇氏法[7]，选取健康昆明种小鼠70只，体质量(20±2)g，雌雄各半，随机分为7组，每组10只。α_Ti3用蒸馏水溶解，0.1 mol/L NaHCO4调节至pH7.0，最高剂量为3 400 mg/kg，最低剂量1 200 mg/kg，公比为1.1896，试验前禁食12 h，按0.2 ml/kg，经口1次灌胃给药，给药后观察小鼠中毒反应，连续观察1周。

1.3　蓄积毒性试验

　　Wistar大鼠40只，体质量(200±20)g，雌雄各半，随机分为对照和实验两组，每组20只。对照组用生理盐水，实验组α_Ti3的剂量分别相当于0.1 LD50、0.15 LD50、0.22 LD50、0.34 LD50、0.5 LD50、0.75 LD50、1.12 LD50，采用定期递增剂量法计算蓄积系数K；以每4 d称1次体质量，绘制生长曲线；采用分光光度法测定肝组织中非蛋白巯基的含量；采用硫代巴比妥法测定肾组织中丙二醛的含量，具体步骤参照文献[7]。

1.4　致突变试验[7]

1.4.1　Ames test　采用平皿掺入法。分别在加与不加S9两种条件下进行测试。设空白对照、溶媒对照、阳性对照、代谢活化(S9)对照和α_Ti3 5个不同剂量组，其剂量分别为每皿31.3、62.5、125、250、500 μg，37 ℃培养48 h后观察结果。每个剂量设3个平行样。试验重复1次。

1.4.2　中国仓鼠卵巢细胞(CHO)染色体畸变试验　将传代生长良好的CHO细胞以5×104 /ml接种于若干培养瓶，在37 ℃培养箱中培养24 h。将α_Ti3配制成40、80、160、320 μg/ml，分别加入不同细胞培养液中，每瓶培养液加0.1ml ,同时设生理盐水空白对照，阳性对照分别用丝裂霉素C(－S9)和环磷酰胺(＋S9)，每个浓度设3个平行样，继续培养24 h。终止培养前3 h每瓶分别加入10 μg/ml的秋水仙碱0.1 ml，二次固定，常规方法制片，Giemsa染色(pH为6.8)，计数分数良好的中期分裂细胞，在油镜下观察并记录染色体畸变类型和畸变数。

1.5　细胞毒性试验

1.5.1　大鼠外周血淋巴细胞　将1只Wistar 大鼠行乙醚麻醉后，75％酒精腹部消毒，无菌条件下打开腹腔，以新鲜肝素湿润的5 ml注射器经腹主动脉采血，500 r/min离心10 min，吸取上清于离心管中，3 000 r/min离心8～10 min，弃上清并混匀，计数板计数，以含10％小牛血清的1640培养液稀释，调整细胞浓度至2×107/ml。以每孔100 μl细胞悬液接种96孔板，加入α_Ti3，使终浓度分别为5.0、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25、0.078 1、0.039 1、0.019 6 mg/ml，每个剂量设3个复孔，37 ℃ 5％CO2培养箱培养24 h。每孔加入0.4％苔盼蓝20 μl，混匀，2～3 min后计数未染色的活细胞。

1.5.2　大鼠骨髓细胞　取1只Wistar大鼠断头处死，无菌条件下取股骨，无菌生理盐水冲洗，剪去股骨两端，用注射器吸取1640培养液冲洗骨髓细胞于离心管中，200目尼龙网过滤至另一离心管中，1 200 r/min离心5 min，弃上清。同样方法用Hank’s液洗涤2次，用含10％小牛血清的1640培养液稀释，调整细胞浓度至2×107/ml。使α_Ti3终浓度分别为2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/ml。阴性对照加生理盐水。

1.6　统计学方法

　　应用SPSS 10.0统计软件，采用t检验、方差分析和相关性分析方法，以α=0.05为检验水准。

2　结　果

2.1　急性毒性试验　　

　　小鼠死亡时间集中在给药后1.5～5 h之间，最后死亡的1例在给药后10 h，之后1周未见死亡，尸体检查发现小鼠存在不同程度的胃及十二指肠粘膜充血。采用改良寇氏法计算α_Ti3半数致死剂量(LD50), LD50为2 055.36 mg/kg,见表1,属于低毒物质。

2.2　蓄积毒性试验

2.2.1　蓄积系数(K)　Wistar大鼠经20 d灌胃给予α_Ti3后，α_Ti3累积剂量已达5.3 LD50，大鼠20 d内无死亡。即蓄积系数K>5。

2.2.2　生长曲线　给药后不同时间大鼠体质量变化情况见图1。从图1中可以看出对照组大鼠在0～20 d体质量逐渐增加，实验组大鼠体质量在给药后亦逐渐增加，但与对照组相比体质量增长略缓，在各时间点上，二者间的差异均无统计学意义(P>0.05)。        

2.2.3　肝组织中巯基含量测定　在蓄积毒性实验第20天断头处死大鼠，分光光度法测定肝脏光密度值，从标准曲线上查得半胱氨酸含量，计算出对照组和实验组肝组织中巯基含量分别为(6.866 6±2.503 8)nmol/g和(5.680 8±0.626 4) nmol/g,二者间的差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2.4　肾组织中丙二醛含量测定　以空白管调零，测得样品管的光密度值，计算出肾组织中丙二醛含量为(9.262 5±1.276 9) nmol/g,与对照组[(6.656 0±1.400 9) nmol/g]间的差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3　致突变试验

2.3.1　Ames试验　结果见表2，从表2中可看出α_Ti3浓度在每皿31.3～500 μg范围内，无论加S9与否，每皿菌落回变数均未超过阴性对照组的两倍，说明α_Ti3对鼠伤寒沙门氏菌无致突变作用。　　　　　　

2.3.2　中国仓鼠卵巢细胞(CHO)染色体畸变试验　结果见表3。由表3中可见α_Ti3浓度在40～320 μg/ml范围内，无论加S9与否，CHO染色体畸变率与阴性对照组比较均无明显增加，染色体畸变率均小于5％；而阳性对照组CP和MMC诱导CHO细胞染色体畸变率明显高于实验组，差异有统计学意义(P<0.01)，畸变类型主要为断裂、易位、碎片及环状染色体等。说明α_Ti3对CHO染色体无致畸变作用。

2.4　细胞毒性　　

　　α_Ti3在不同浓度下对大鼠外周血和骨髓细胞表现出抑制效应，且抑制作用呈明显的线性关系(表4、5)。以对数浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，求得半数抑制浓度(IC50)分别为0.135和0.223 mg/ml，高于S180腹水瘤细胞(0.078 1～0.156 3) mg/ml和小鼠肝癌细胞(0.078 1～0.156) mg/ml[10]，说明α_Ti3对正常细胞的毒性较低。

3　讨　论

　　本试验急性毒性结果表明：α_Ti3的LD50为2 055.36 mg/kg，根据外来化合物急性毒性分级标准，属低毒物质。与目前临床上广泛使用的抗肿瘤药物顺铂相比毒性要低得多[8－9]。

　　蓄积试验测得蓄积系数K>5，根据蓄积系数评价标准，α_Ti3的蓄积作用极弱，表明α_Ti3在大鼠体内有轻度蓄积性。实验组大鼠体质量在给药后亦逐渐增加，与对照组相比体质量增长略缓，在各时间点上，二者相比差异无统计学意义，说明α_Ti3的毒性较低。且α_Ti3试验组肝组织中巯基含量与对照组差异无统计学意义(P>0.05)，可能有3个原因：一是α_Ti3对肝脏的毒性较轻，对肝组织损害作用较小；含钛代谢产物主要积累在肝和肠，有限的肝脏毒性可能是金属茂类化合物的主要毒性。另一种可能是α_Ti3对肝组织有一定的损害作用，但经过一段时间后，由于机体的代偿作用，而表现出对肝组织没有损害。还有一种可能是α_Ti3经肝脏的生物转化后，形成毒性较低或基本无毒的代谢产物排出体外。

　　致突变试验结果表明：α_Ti3对鼠伤寒沙门氏菌无致突变作用，对CHO染色体无致畸变作用。细胞毒性试验结果表明，α_Ti3对大鼠外周血细胞和骨髓细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为0.135和0.223 mg/ml，高于S180腹水瘤细胞[(0.0781～0.156 3) mg/ml]和小鼠肝癌细胞[(0.0781～0.156) mg/ml][10]，说明该药对正常细胞的毒性较低，具有一定的细胞选择性。文献报道，在相同剂量下抗肿瘤药物卡铂、环酸、双环铂对大鼠均有不同程度毒性作用[11]。杂多化合物九钨三钛硅酸盐在本实验中显示低毒，低于临床常见的抗肿瘤药物的细胞毒性，提示其具有良好的应用前景。　　

参考文献

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收稿日期： 2010－09－18； 修订日期： 2010－10－20

作者简介： 梅树江(1966－　)，男，吉林省四平市人，硕士，副主任医师，研究方向：毒理学与疾病预防控制。

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