吴彬彰1/赵　阳2/王剑清2/叶卓明3,/张　宝4/李洪才3

(1.南方医科大学口腔医学院， 广东 广州510515； 2. 南方医科大学第一临床医学院， 广东 广州 510515； 3.南方医科大学公共卫生与

热带医学学院， 广东 广州 510515； 4.南方医科大学基因工程研究所，广东 广州 510515)

The effects of tea polyphenols on eliminating exogenous nitrite

WU Bin_zhang1， ZHAO Yang2， WANG Jian_qing2，YE Zhuo_ming3,， ZHANG Bao4， LI Hong_cai3

(1. School of Stomatology, Southern Medical University， Guangzhou

510515; 2.First Clinical College, Southern Medical University，

Guangzhou 510515; 3.School of Public Health and Tropical

Medicine,Southern Medical University，Guangzhou 510515;

4.Institute of Genetic Engineering, Southern Medical University，

Guangzhou 510515,Guangdong, China)

　　【摘要】 目的： 在体内外环境下，观察茶多酚(tea polyphenols,TP)对外源性亚硝酸盐的清除作用。方法： 在体外模拟胃液环境(37 ℃恒温,pH=3)于不同作用时间下测定TP对亚硝酸盐的清除率；18只SD大鼠灌胃NaNO2 40 mg/kg后，随机分为立即TP灌胃组(TP 100 mg/kg)、NaNO2灌胃15 min后TP灌胃组(TP 100 mg/kg)和对照组(NaNO2灌胃15 min后灌胃蒸馏水)，分别在NaNO2灌胃15、30、45、60、90 min后于大鼠尾部取血，采用Griess比色法测定血清中的亚硝酸盐浓度。结果： 在体外环境下，10 min时TP对亚硝酸盐清除率即可达到94.4％，之后随着时间的延长各实验组清除率间的差异无统计学意义(P>0.05)。体内环境下，对照组大鼠，15 min后血中亚硝酸盐浓度开始升高，至45 min时达到最大值(0.793±0.110) mg/L，60 min时降至最低(0.646±0.088) mg/L；立即TP灌胃组15 min后血中NaNO2浓度最大(0.599±0.154) mg/L，以后逐渐减低，45 min达最低(0.461±0.098) mg/L，然后逐渐趋于稳定；15 min后TP灌胃组，45 min后血中NaNO2浓度最大(0.653±0.220) mg/L，在60 min时降到最低水平(0.484±0.198) mg/L，然后趋于平衡。在30 min后TP立即灌胃组血中NaNO2浓度低于对照组和15 min后TP灌胃组，差异具有统计学意义(P<0.05)。 结论： 体内体外环境下TP对外源性亚硝酸盐均有清除作用，TP立即灌胃组清除外源性NaNO2的效果优于15 min后的TP灌胃组。提示早期使用茶多酚可以在胃内清除外源性的亚硝酸盐，当外源性的亚硝酸盐入血后，茶多酚对其清除作用有限。

　　【关键词】 茶多酚； 外源性亚硝酸盐； 清除作用

　　中图分类号： R155.3　　　　文献标识码： A　　　　文章编号： 1004－616X(2010)06－0473－04

　　【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To investigate the elimination effect of tea polyphenols on exogenous nitrite both in vitro and vivo. METHODS: To measure the elimination rate of tea polyphenols on exogenous nitrite within simulated gastric juice in vitro(37 ℃,pH=3). A total of 18 SD rats were randomly divided into 3 groups after administrating intragastrically with 40 mg/kg nitrite: group A(treated with 100 mg/kg tea polyphenols by gavage immediately),group B(treated with 100 mg/kg tea polyphenols by gavage 15 min later),group C(treated with distilled water by gavage 15 min later,blank control).Then the concentrations of nitrite in rat plasma at different times were determined by Griess colorimetric method. RESULTS: After TP was mixed with nitrite for 10 minutes in vitro, the nitrite clearance rate was up to 94.4％. The elimination rates showed no statistical significance as time prolonged(P>0.05). The concentrations of plasma nitrite in group C increased after 15 min and reached its peak of (0.793 ±0.110) mg/L 45 min later,then decreased to the minimum of (0.646±0.088) mg/L 60 min later.The concentrations of plasma nitrite in group A reached a peak of (0.599±0.154) mg/L 15 min later, reduced gradually to a minimum of (0.461±0.098) mg/L 45 min later, then remained stable. Rats in group B developed peak plasma nitrite of (0.653±0.220) mg/L 45 min later, fell to a minimum of (0.484±0.198) mg/L 60 min later,then remained stable. At 30 min, the concentration of plasma nitrite of group A was significantly lower than group B and C(P<0.05）. CONCLUSION: Tea polyphenols could eliminate exogenous nitrite both in vitro and vivo.The elimination of immediate treatment with tea polyphenols by gavage was significantly more effective than the treatment 15 min later. Early treatment with TP could effectively eliminate the nitrite in stomach. After exogenous nitrite was absorbed into the blood, the eliminating effect of TP was limited.

　　【KEY WORDS】 tea polyphenols； exogenous nitrite； eliminating effect

　　亚硝胺和大多数N_亚硝基化合物是强致癌物，到目前为止，已经测试了大约130种N_亚硝基化合物，其中约有90％具有致癌性，可引起动物的不同组织器官发生肿瘤。目前认为内源性合成的亚硝胺是重要的来源。人和动物的体内均可使亚硝酸盐、硝酸盐和胺类生成亚硝基化合物，人体内合成亚硝胺类化合物的主要场所是胃[1－2]。大量报道表明各种茶叶均有阻断N_亚硝基化合物合成的作用，并认为茶叶中茶多酚(tea polyphenols,TP)的阻断作用最大，凡是茶多酚含量越高的茶叶，其阻断效果越好[3－5]。茶多酚对亚硝酸盐的体外研究文献众多，但体内作用的研究少见。本文旨在通过大鼠的体内实验的观察结果，研究不同时间灌胃茶多酚大鼠血清中亚硝酸盐的变化情况，确定茶多酚对外源性亚硝酸盐的清除作用。

1　材料与方法

1.1　实验动物

　　SD大鼠18只，体质量180～220 g，雌雄各半，由南方医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(粤)2006－0015。

1.2　主要药品、试剂与仪器

　　茶多酚(tea polyphenols,TP)，纯度≥98％，表没食子儿茶素没食子酸脂(epigallocatechin gallate,EGCG)含量≥50％，批号F07079501，购于广州日康食用化工有限公司；对氨基苯磺酰胺(北京恒业中远化工有限公司)；盐酸N_(1_萘基)_乙二胺(天津傲然精细化工研究所)；亚硝酸钠(天津市福晨化学试剂厂)，所有试剂均为分析纯。酶标仪(680型美国BIO_RAD)，DK_8D型电热恒温水槽(上海)，microFUGE18型台式高速离心机(上海一恒科技有限公司产)。

1.3　体外实验

　　取3.6 mg/ml茶多酚溶液5 ml分别放入1～9号50 ml比色试管中，各加2.4 mg/ml 的NaNO2 3 ml。(即按大鼠180 g，用量100 mg/kg计算；相当于茶多酚18 mg，亚硝酸钠7.2 mg)。用磷酸_柠檬酸缓冲液将比色试管中的pH 值调整至3。将比色试管放置于37 ℃恒温水浴中，1～9号50 ml比色试管分别反应10、20、30、40、50、60、70、80、90 min,取出后立即加入2 ml 0.4％对氨基苯磺酸液,混匀,静置3～5 min。向比色试管内分别加入0.2％盐酸萘乙二胺溶液1 ml，加水至50 ml，混匀，静置15 min[6]。将上述比色试管中的溶液分别倒入20 mm的比色杯中，使用722型光栅分光光度计在538 nm处分别测定其吸光度。绘制NaNO2标准曲线得到相应的NaNO2含量，通过下列公式计算NO2ˉ清除率。

　　NO2ˉ清除率(％)=(标准的NaNO2含量－NaNO2残留量)/标准的NaNO2含量×100％

1.4　体内实验

1.4.1　实验分组与处理方法　实验分为茶多酚不同给药时间的2个实验组和阴性对照组，每组6只大鼠。各组大鼠均在首次灌胃前禁食12 h。实验组给大鼠按NaNO2 40 mg/kg 灌胃后，分别于立即和15 min后用茶多酚灌胃(100 mg/kg)；对照组大鼠则于NaNO2(40 mg/kg)灌胃15 min后用等体积蒸馏水灌胃。上述各组大鼠分别在灌胃NaNO2 15、30、45、60、90 min后，通过剪掉其少量尾部组织及适度挤压取血，每次取血液1～1.5 ml于离心管中。

1.4.2　Griess试剂配制　称取500 mg对氨基苯磺酰胺，溶于100 ml双蒸水中，配制成0.5％的对氨基苯磺酰胺，置棕色瓶中，4 ℃保存备用；称取500 mg的盐酸N_(1_萘基)_乙二胺，溶于100 ml双蒸水中，配制成0.5％的盐酸N_(1_萘基)_乙二胺，置棕色瓶中，4 ℃保存备用。Griess试剂是样品(标准品)∶1 mol/L HCl∶0.5％对氨基苯磺酰胺∶0.5％的盐酸N_(1_萘基)_乙二胺为2∶1∶0.5∶0.5的混合物。

1.4.3　亚硝酸钠标准曲线的制备　取浓度5.000、2.500、1.250、0.625、0.156、0.078 mg/L的亚硝酸钠各2 ml，加入1 mol/L的HCl 1 ml，0.5％对氨基苯磺酰胺、0.5％的盐酸N_(1_萘基)_乙二胺各0.5 ml，放置20 min后，于波长540 nm处，酶标仪测定样品D(540)值。直线回归方程：Y=0.1135X＋0.0482， r=0.9998,其中Y为吸光度值，X为亚硝酸盐浓度(mg/L)，r为相关系数，见图1。

1.4.4　血清中NO2ˉ含量测定　将上述各血样标本离心(3 000 r/min，15 min)，取血清100 μl，加入30％硫酸锌20 μl，再加0.5 mol/L氢氧化钠130 μl，使pH值为9左右，再于50 ℃中保温10 min，当出现白色絮状沉淀物时，取出，冷却后用带膜离心管过滤，取120 μl滤液做NO2ˉ含量测定[7－9]。

1.5　统计学方法

　　采用SPSS13.0统计分析软件处理数据，用方差分析进行统计学检验[10]。

2　结　果

2.1　体外模拟胃液环境下TP对亚硝酸盐的清除作用

　　结果见表1。在作用时间的范围内，TP对亚硝酸钠均有很高的清除效果。10 min时即可达到94.4％的清除率，70、80、90 min时间点达到最高的清除率96.5％。可得出，在此TP和亚硝酸钠量的条件下模拟胃液环境，TP对亚硝酸钠的清除迅速，且随着时间的延长清除率的变化不大。

2.2　TP对正常大鼠外源性亚硝酸盐的影响

　　结果见表2、图2。灌胃亚硝酸盐后，各组不同时点大鼠血中亚硝酸盐浓度之间的差异具有统计学意义(F=4.738，P=0.002)。对照组大鼠蒸馏水灌胃后15 min时血中亚硝酸盐浓度开始升高，至45 min时达到最大值0.793±0.110 mg/L，60 min降至最低0.646±0.088 mg/L；茶多酚立即灌胃组在茶多酚灌胃后15 min时血中亚硝酸盐浓度最大0.599±0.154 mg/L，以后逐渐减低，至45 min达最低0.461±0.098 mg/L，然后逐渐趋于稳定；15 min后茶多酚灌胃组在45 min时血中亚硝酸盐浓度最大0.653±0.220 mg/L，在60 min时降到最低水平0.484±0.198 mg/L，然后趋于平衡。各组间血中亚硝酸盐浓度的差异均具有统计学意义(F=5.601，P<0.05)；从各时间点看，除15 min时各组间血中亚硝酸盐浓度的差异无统计学意义(F=1.297，P>0.05)外，其余各时间点茶多酚立即灌胃组和15 min后灌胃组大鼠血中亚硝酸盐浓度均明显低于对照组 (P<0.05)，而在30 min和45 min时间点，茶多酚立即灌胃组大鼠血中亚硝盐浓度明显低于15 min后灌胃组 (P<0.05)。

3　讨　论

　　我国饮用水和日常食品中不同程度地含有亚硝酸盐成分。亚硝酸盐氮是饮用水水质污染的重要指标之一,已被证实可引起癌症和儿童高铁血症等多种疾病, 国外对水体中“三氮”的含量非常重视, 其中尤以对亚硝酸盐氮更为关注[11]。亚硝酸盐在日常食品中腌制的鱼肉最高(8.28 mg/kg),腌菜类较高(3.52 mg/kg)，日本谷村显雄曾报道：60 kg男子重体力劳动者日允许摄入亚硝酸盐量为8 mg，由此估计，每人每日摄入亚硝酸盐的量超过标准[12]。正常人的胃液pH值一般为1～4，此时仲胺和亚硝酸盐极易形成亚硝胺。胃液的硝酸盐及亚硝酸盐来自唾液、食物和水。胃酸缺乏或有胃炎的患者，胃液pH值高，当pH值大于5时，含有硝酸盐还原酶的细菌具有高度的活性，使硝酸盐还原成亚硝酸盐，因此使胃内有较多的亚硝酸盐形成。另外亚硝酸盐被吸收入血速度快，不同文献用不同实验方法测得大鼠灌胃亚硝酸盐后15～40 min血中亚硝酸盐浓度达到最大，在本实验中，灌胃亚硝酸盐后15 min再灌胃蒸馏水组45 min后血清亚硝酸盐浓度即可达到峰值。有文献显示通过N13标记后，测得灌胃亚硝酸盐后45 min内，标记N13的亚硝酸盐60％左右出现在大鼠胃内[13－15]。

　　健康人饮用绿茶(按20 mg/kg)后，血浆中的茶多酚单体表没食子儿茶素没食子酸脂(EGCG)、没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)在1.3～1.6 h达到峰值[16]。茶多酚属低毒性,对大鼠每天用0.8 g/kg的剂量相当于成人用量的100倍以上,提示临床用药量是安全的[17]。茶多酚有较Vit C、E更强的抗氧化、清除自由基的作用，其主要通过以下4个机制[18]：①因茶多酚具有“Catechol”结构,从而是很强的金属离子螯合剂； ②茶多酚是超氧阴离子自由基和羟自由基很强的捕获剂；③活性氧自由基能损伤DNA,改变基因表达,在肿瘤发生中起重要作用。黄烷醇类能与过氧自由基发生反应,从而终止脂质过氧化链反应；④增强谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、酯还原酶、谷胱甘肽_S_转移酶的活性。本文所得结果表明了茶多酚具有清除亚硝酸盐的作用，不同时间灌胃茶多酚对体内外源性亚硝酸盐的清除作用存在差异，茶多酚对外源性亚硝酸盐在胃内的清除作用大于在血液中的清除作用。本实验显示，不同时间灌胃茶多酚对体内外源性亚硝酸盐的清除作用存在差异，早期使用茶多酚可以较好地减少胃内外源性的亚硝酸盐，比外源性的亚硝酸盐入血后再使用茶多酚效果明显，从而降低了致癌性物质形成的可能。由此提示人们在日常生活中，从减少致癌物质形成的角度考虑，可在食用含亚硝酸盐的食物后早期饮茶，有助于清除外源性的亚硝酸盐。

　　(本研究主要工作在南方医科大学公共卫生与热带医学学院环境卫生学系实验室完成，特此致谢。特别感谢南方医科大学生物统计系钟克波老师的指导，以及第一临床医学院杨然和白雨豪同学的帮助)

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收稿日期： 2010－06－13； 修订日期： 2010－09－06

基金项目： 广东省反恐技术中心研究项目(2006E33761001－7)；南方医科大学课外科研项目(208kw170)

作者简介： 吴彬彰(1989－　)，男，湖北洪湖人，本科生。

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