梁　欣/李文丽＃/海春旭/杨薛康/张　伟/柏　桦

(第四军医大学军事预防医学系毒理学教研室，陕西 西安 710033)

Oxidative damage which caused by γ_rays promotes aging

LIANG Xin， LI Wen_Li， HAI Chun_xu， YANG Xue_kang， ZHANG Wei， BAI Hua.

(Department of Toxicology，the Fourth Military Medical University， Xi'an 710033，Shanxi， China)

　　【摘要】 目的： 利用γ射线照射引起氧化损伤，观察氧化损伤与衰老的关系。 方法： 将60只昆明小鼠随机分成对照组、D_半乳糖组、γ射线组和D_半乳糖＋γ射线组，共4组，每组15只。D_半乳糖组于小鼠腹腔注射D_半乳糖建立衰老模型，γ射线组给予γ射线全身照射， D_半乳糖＋γ射线组在小鼠腹腔注射D_半乳糖的同时给予射线照射，对照组给小鼠腹腔注射等量的生理盐水。各组小鼠按上述处理80 d后处死，取材，观察肝、脑组织超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量，脂褐素含量,血清晚期糖基化终产物(AGEs)水平和肝组织β_半乳糖苷酶染色情况。结果： 与对照组相比，D_半乳糖组小鼠肝、脑组织的SOD活性降低(P<0.05），MDA含量、血清AGEs水平和脂褐素含量升高(P<0.05），肝脏β_半乳糖苷酶染色呈阳性改变；γ射线组小鼠肝、脑组织SOD活性降低(P<0.05），MDA含量、脂褐素含量升高(P<0.05），肝脏β_半乳糖苷酶染色呈阳性改变，血清AGEs水平变化不明显(P>0.05)。与D_半乳糖组相比， D_半乳糖＋γ射线组小鼠肝、脑组织的SOD活性降低(P<0.05），MDA含量、血清AGEs水平和脂褐素含量升高(P<0.05），肝脏β_半乳糖苷酶染色表达增强。 结论： γ射线全身照射后可加重氧化损伤，进而促进衰老的改变。

　　【关键词】 衰老； 自由基； 氧化损伤

　　中图分类号: R332　　　　文献标识码: A　　　　文章编号: 1004－616X(2010)05－0335－04

　　【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To assess the relation of aging and oxidative damage caused by γ_rays． METHODS: 60 mice were divided into 4 groups：group A was control group; mice of group B were treated with intraperitoned D_galactose; mice of group C were irradiated by γ_rays; mice of group D were treated with D_galactose and irradiation. The activity of SOD，contents of MDA and lipofuscin and AGEs in blood serum were determined，the expression in of β_galactosidase by staining was measured at the end of 80 days' experiment． RESULTS: Compared with group A, the activity of SOD was decreased in group B(P<0.05)，the level of AGEs and contents of MDA and lipofuscin increased in group B(P<0.05), also the β_galactosidase activity was positive. The activity of SOD was decreased in group C(P<0.05)，contents of MDA and lipofuscin increased in group C(P<0.05),also the β_galactosidase activity was positive, but no significant difference was found in the level of AGEs in group C(P>0.05). Compared with group B, the activity of SOD was decreased in group D(P<0.05)，the level of AGEs and contents of MDA and lipofuscin were increased in group D(P<0.05), also the β_galactosidase activity was raised. CONCLUSION:Aging was enhanced by oxidative damage caused by γ_rays.

　　【KEY WORDS】 aging； free radicals； oxidative damage

　　关于衰老机制的学说，到目前为止国内外学者提出了近300种，衰老的自由基理论是其中最有影响的学说之一。然而衰老的自由基理论并没有完全解释衰老的本质，关于自由基到底是机体损伤的因还是果并没有定论，而且自由基与衰老的直接关系尚未建立，许多基于衰老自由基理论而建立的衰老模型与自然衰老模型也存在一定的差距，这些都使得该领域的研究一度陷入彷徨[1－4]。但是不可否认的是，不论自由基的产生是因还是果，在衰老进程中，自由基引起的氧化损伤发挥了重要的作用，许多学者通过各种抗氧化剂的干预确实延长了实验动物的寿命。本实验在前人的工作基础上建立衰老模型[5]，通过γ射线照射引起氧化损伤，观察氧化损伤对衰老指标的影响，进一步研究自由基的促衰老作用，为下一步的抗衰老研究提供基础。

1　材料与方法

1.1　动物分组及处理

　　二级雄性昆明小鼠60只，体质量为(20±2)g，随机分成D_半乳糖组、γ射线照射组、D_半乳糖＋γ射线照射组和对照组，共4 组，每组15只。D_半乳糖组组给予腹腔注射D_半乳糖(0.3 mg/g体质量，每天1次，共80 d)；γ射线照射组给予3 Gy全身照射(照射面积为25 cm×25 cm，照射源距动物的高度为100 cm，每次照射1 min 22 s)，每10 d 1次，共8 次，总计24 Gy；D_半乳糖＋γ射线照射组在小鼠腹腔注射D_半乳糖(0.3 mg/g体质量，每日1次，共80次)的同时给予射线照射(处理方式与射线组相同)；对照组小鼠给予腹腔注射等量的生理盐水。所有动物给予常规饲料，自由摄食、饮水。各组按上述处理后断头处死动物，取肝、脑、胸腺和脾脏，并记录其脏器质量。另取部分肝组织置于多聚甲醛中用于免疫组化染色，其余冻存，用于相关指标的测定。

1.2　试剂与仪器

　　硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)和MDA标准品为Merck公司产品；牛血清白蛋白(BSA)为华美试剂公司产品；三羟甲基氨基甲烷(trisaminomethane, Tris)、氯仿、甲醇、蔗糖、抗坏血酸、硫酸亚铁和四氯化碳(CCl4)等均为国产AR试剂。3K30型台式高速冷冻离心机(美国Sigma公司)； 501型超级恒温器(重庆实验设备厂)；722型光栅分光光度计(山东高密分析仪器厂)；台式自动平衡记录仪(上海大华仪表厂)；774型磁力恒温搅拌器(江苏泰县仪器厂)；QT_1漩涡混合器(上海琪特分析仪器有限公司)；D40_1型电动匀浆器(浙江杭州仪表电机厂)；970CRT型荧光分光光度计(上海分析仪器总厂)；CM1900冰冻切片机(德国LEICA公司)；BX51荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)。

1.3　SOD活性和MDA含量的测定[6]

　　取肝、脑组织样品,按质量比1∶9加入生理盐水,在冰浴环境下匀浆, 以3 000 r/min 离心,取30 μl上清液，用改良的盐酸羟胺法测定SOD活性，用荧光法测定MDA含量。

1.4　脂褐素含量的测定[7]

　　取新鲜肝、脑组织200 mg，用氯仿_甲醇液(体积比为2∶1)4 ml制备匀浆，而后加入等量蒸馏水剧烈震荡3 min，3 000 r/min离心10 min，吸取氯仿层于另一试管中，加氯仿5 ml，紫外灯下照射30 s，以激发波长360 nm，发射波长450 nm处测定样品荧光强度。以新配制的硫酸奎宁标准液(1 μg/ml)荧光强度为50，再计算出样本中荧光物质的浓度。

1.5　血清AGEs的检测[8]

　　晚期糖基化终产物(advanced glycation endoproducts,AGEs)具有自发荧光的特性，根据其特定波长下的荧光值来反映样本AGEs水平。将血清50 μl以PBS稀释100倍，滤器过滤后，在日立650_60荧光分光光度计上测定其荧光值(激发波长370 nm，狭缝5 nm，发射波长440 nm，狭缝5 nm)。纯化的AGE_BSA稀释成不同浓度后用做标准品，根据其荧光值绘制标准曲线，拟合方程，计算出AGEs值(F_AGE)，1单位F_AGE相当于1 μg/ml AGE_BSA。

1.6　冰冻切片的制作与β_半乳糖苷酶染色测定[9]

　　动物处死后迅速取各组小鼠肝脏的部分组织置于多聚甲醛(40 g/L)中固定,持续4～6 h后取出，以蔗糖(250 g/L)浸泡过夜，用冰冻切片机切制成厚约8 μm的标本。新鲜配制SA_β_Gal孵育液:1 g/L X_Gal, 40 mmol/L柠檬酸缓冲液, pH6.0, 5 mmol/L亚铁氰化钾,5 mmol/L铁氰化钾, 150 mmol/L NaCl, 2 mmol/L MgCl2 。置于37 ℃孵箱中过夜,显色。PBS冲洗, 10 g/L中性红复染胞核，中性树胶封片，油镜下观察结果。

1.7　统计学方法

　　数据用－±s表示，统计学分析应用SPSS 10.0统计软件处理数据，显著性检验采用方差分析，以α=0.05为检验水准。

2　结　果

2.1　MDA含量与SOD活力的变化

　　由表1可见，D_半乳糖组、γ射线照射组、D_半乳糖＋γ射线照射组小鼠肝、脑MDA含量均显著高于对照组(P<0.05)；D_半乳糖＋γ射线照射组小鼠的肝、脑MDA含量高于D_半乳糖组(P<0.05)。D_半乳糖组、γ射线照射组、D_半乳糖＋γ射线照射组小鼠的肝、脑SOD活性显著低于对照组(P<0.05)；D_半乳糖＋γ射线照射组小鼠的肝、脑SOD活性低于γ射线照射组(P<0.05)。

2.2　小鼠脂褐素含量的变化

　　由表2可见，D_半乳糖组、γ射线照射组和D_半乳糖＋γ射线照射组小鼠的肝、脑脂褐素含量高于对照组(P<0.05)；D_半乳糖＋γ射线照射组小鼠的肝、脑脂褐素含量显著高于D_半乳糖组(P<0.05)。

2.3　小鼠血清AGEs含量的变化

　　由表3可见，D_半乳糖组和D_半乳糖＋γ射线照射组小鼠血清AGEs水平高于对照组(P<0.05)；γ射线照射组的血清AGEs水平与对照组间的差异无统计学意义(P>0.05)；D_半乳糖＋γ射线照射组的血清AGEs水平高于D_半乳糖组(P<0.05)。

2．4　肝脏β_半乳糖苷酶染色观察 

　　如图1所示，D_半乳糖组、γ射线照射组、D_半乳糖＋γ射线照射组小鼠的肝组织切片上可见肝小叶中央静脉周围肝细胞间质有散在的阳性蓝色细颗粒分布(图B、C、D)；对照组(图A)肝切片中无明显阳性蓝色颗粒。

3　讨　论

　　在生命过程中，当生长发育达到成熟期以后，随着年龄的增长，机体在形态结构与生理功能方面呈现出各种不利于自身健康的退行性变化，这些变化不断发生和发展的过程就称为衰老。丙二醛(MDA)是活性氧引起的脂质过氧化反应的终产物，主要反映氧化损伤的程度，研究发现其可随着机体年龄的增大呈上升趋势，故在一定程度上也可以反映机体的衰老情况[10]；超氧化物歧化酶(SOD)可通过歧化反应将超氧阴离子自由基转化为过氧化氢和氧气，主要反映机体的抗氧化能力[10]；研究表明，脂褐素含量、晚期糖基化终产物(AGEs)的水平和β_半乳糖苷酶染色的阳性率都有随着年龄增长而增加的趋势，是目前应用较为广泛的衰老生物学标志[11－14]。

　　本实验结果表明：与对照组相比，D_半乳糖组SOD活性降低、MDA含量升高(P<0.05)，脂褐素含量、血清AGEs水平均显著升高(P<0.05)，β_半乳糖苷酶染色呈阳性改变，这些均符合衰老改变，说明衰老模型的建立是成功的。与对照组相比，射线组的SOD活性降低、MDA含量升高(P<0.05)，说明γ射线全身照射后的确造成了机体的氧化损伤，与国内外文献报道一致；脂褐素含量显著升高(P<0.05)，β_半乳糖苷酶染色呈阳性改变，这与我们实验室曾利用γ射线全身照射建立小鼠急性衰老模型的结果一致；但血清AGEs水平没有变化(P>0.05)，不符合正常衰老进程，这也可能正是γ射线致小鼠衰老模型的不足之处。与D_半乳糖组相比，D_半乳糖＋射线组的SOD活性降低、MDA含量升高(P<0.05)，脂褐素含量、血清AGEs水平显著升高(P<0.05)，β_半乳糖苷酶染色表达增强，说明D_半乳糖致衰老模型经γ射线照射后氧化损伤加重，促进了衰老改变。以上数据结果还发现，单纯射线照射引起氧化损伤并没有引起血清AGEs水平的变化，但在D_半乳糖致衰老模型的基础之上给予射线照射时加重了氧化损伤，其血清AGEs水平明显升高，提示自由基引起的氧化损伤可能不是衰老的根本原因，但氧化损伤的确促进了衰老进程。

　　综上，D_半乳糖致衰老模型经γ射线全身照射后可加重氧化损伤，进而促进衰老改变。

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收稿日期： 2010－06－18； 修订日期： 2010－07－05

作者简介： 梁　欣(1957－　)， 女，黑龙江哈尔滨市人，硕士，研究方向：自由基生物学。E－mail：sunshine_lovet@126.com，＃该作者对本文的贡献与第一作者等同。

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