任晓梅1/夏　蕾2/王　栋1/张　岭1/侯绍英1/赵　巍3/吴　坤1,

(1． 哈尔滨医科大学公共卫生学院营养与食品卫生教研室，黑龙江 哈尔滨 150081； 2．哈尔滨医科大学附属第一医院生殖医学中心，黑龙江 哈尔滨 150001； 3．哈尔滨市第一医院骨外二科，黑龙江 哈尔滨 150010)

Effects of thioglycolic acid on parthenogenetic activation of xenopus oocytes

REN Xiao_mei1， XIA Lei2， WANG Dong1， ZHANG Ling1，HOU Shao_ying1， ZHAO Wei3， WU Kun1,

(1. Department of Nutrition and Food Hygiene, School of Public Health, Harbin Medical University, Harbin 150081;2. Department of Reproductive Medicine, The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001; 3.The Second Department of Orthopaedics,the First Hospital in Harbin,Harbin 150010, China)

　　【摘要】 目的： 探讨巯基乙酸(thioglycolic acid, TGA)对钙离子载体A23187诱导的非洲爪蟾卵母细胞体外孤雌激活的影响，探讨孤雌激活的机制。方法： 体外孕酮诱导爪蟾卵母细胞成熟后，选取MII期细胞用不同浓度TGA(0、5、25、125 μg/ml)处理2 h，再用钙离子载体A23187诱导激活，在加入激活剂后不同时间(0、10、20、30、60 min)记录激活的卵母细胞数量，计算其激活率；加入激活剂后60 min收集卵母细胞，进行荧光染色观察原核形成情况；采用Western Blotting检测CyclinB2、Mos、p_ERK1/ERK1的表达。结果： 不同浓度的TGA均降低非洲爪蟾卵母细胞的孤雌激活率，与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)；激活后对照组卵母细胞在动物极中央形成一个圆形的受精斑，而TGA125 μg/ml处理后形成的受精斑形状不规则且周围毛糙不齐；荧光染色发现对照组细胞中有清晰的原核形成，而TGA处理组则未发现；Western Blotting 分析结果显示，经TGA处理可抑制CyclinB2、Mos、p_ERK1在孤雌激活时的降解。 结论： TGA可以抑制钙离子载体A23187诱导的非洲爪蟾卵母细胞体外孤雌激活，其作用机制可能与干扰成熟促进因子(MPF)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在孤雌激活时的正常降解有关。

　　【关键词】 巯基乙酸； 卵母细胞； 孤雌激活

　　中图分类号： R730.45　　　　文献标识码： A　　　　文章编号： 1004－616X(2010)05－0356－05

　　【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To investigate the effects of thioglycolic acid(TGA) on calcium ionophore A23187_ induced parthenogenetic activation of xenopus oocytes and its possible mechanism. METHODS: Xenopus oocytes were pretreated with TGA in vitro at the doses of 0, 5, 25, 125 μg/ml, and then activated by A23187. During this process, the activation rates were noted. Oocytes were collected 1h after the addition of A23187 and stained with Hoechst 33258 to check the formation of pronucleus. RESULTS: Following TGA treatment, the black spot appeared on the animal pole, known as fertilization coat, which was not in good condition. TGA significantly inhibited the rate of parthenogenetic activation(P<0.05) and the formation of pronucleus. Through Western Blotting analysis, TGA inhibited the degradation of Mos, p_ERK1 and CyclinB2. CONCLUSION:TGA treatment could inhibit the parthenogenetic activation of xenopus oocytes induced by A23187, possibly due to the down_regulation of MPF and MAPK degradation.

　　【KEY WORDS】 thioglycolic acid；oocytes；parthenogenetic activation

　　孤雌激活(parthenogenetic activation)是指处于第二次减数分裂中期(MII期)的成熟卵母细胞不经过精子受精作用，而在某些理化因素的刺激下继续生长发育的过程，包括恢复并完成第二次减数分裂、发生卵裂形成早期胚胎。孤雌激活作为受精机制的研究模型，不但有助于分析卵母细胞受精失败的原因，还可以帮助寻找一种符合生理条件的卵母细胞辅助激活方法，在临床上用于提高人类辅助生殖技术的受精率和诊疗一些生殖疾病。

　　巯基乙酸(thioglycolic acid, TGA)，又名硫氢基乙酸、硫代乙醇酸，是一种重要的精细化工产品。TGA作为持久性卷发剂的重要成分而广泛应用于美容美发行业。有研究表明TGA具有经皮急性和亚慢性毒性，并且具有诱变毒性[1]。本课题组前期研究发现，TGA可以抑制小鼠卵母细胞体外成熟，影响其减数分裂进程，并干扰卵母细胞成熟过程纺锤体的形成和染色体正常排列[2]；对孕酮诱导的非洲爪蟾卵母细胞的体外成熟具有抑制作用[3]。在此基础上，我们进一步探讨TGA对爪蟾卵母细胞孤雌激活的影响，以对其毒性做出更全面的评价。

1　材料与方法

1.1　材料

　　成年雌性爪蟾，购自中科院遗传与发育研究所。TGA、孕马血清促性腺激素(PMSG)、孕酮、钙离子载体A23187和Hoechst 33258、磷酸酶抑制剂均购自Sigma 公司；I 型胶原蛋白酶购于Roche公司；丙酮酸钠、甲苯基磺酰氟(PMSF)购自Amresco公司；PVDF膜购自Gibco公司；p_ERK1、ERK1、Mos蛋白抗体购自Santa Cruz公司；CyclinB2蛋白抗体购自Abcam公司；Ca2＋ _free ND96 培养液按照Martinez等[4]的方法配制； MMR培养液、HEPES缓冲液和固定液按照Anna等[5]的方法配制，2 mg/ml 胶原蛋白酶溶液用Ca2＋ _free ND96 培养液配制。体视显微镜型号为Olympus SZ_61。荧光显微镜型号为Olympus IX_70。

1.2　实验方法

1.2.1　非洲爪蟾卵母细胞的获取与培养

　　每只爪蟾经背部淋巴囊给予50 IU的PMSG, 7 d 后，按照张晓东等[6]的方法进行取卵。爪蟾置于冰块中麻醉，手术取出适量卵块，用眼科弯镊小心撕开，于Ca2＋_free ND96 培养液中反复冲洗至液体澄清，2 mg/ml I型胶原蛋白酶于22 ℃消化2 h后，用Ca2＋ _free ND96 培养液反复冲洗，随后将卵细胞移入盛有MMR的培养皿中。在体视显微镜下, 用眼科弯镊进行分离, 挑选V和VI期发育成熟的卵母细胞，加入孕酮浓度为1 μmol/L的MMR中孵育过夜。次日，挑选发生生发泡破裂(germinal vesicle breakdown, GVBD)的成熟卵母细胞备用。每次实验所用细胞来自3只爪蟾。将选出的卵母细胞移入含不同浓度TGA(0、5、25、125 μg/ml)的MMR中处理2 h,之后用MMR反复冲洗。2.5 μmol/L的钙离子载体A23187诱导激活，分别于加入激活剂后0、10、20、30、60 min观察并记录发生激活的细胞数目，计算激活率，激活判断标准为受精斑的形成。

1.2.2　荧光显微镜观察

　　加入激活剂后60 min收集细胞，参考Anna等[5]的方法进行荧光染色。室温下，用HEPES固定液(含3.7％甲醛，0.1％戊二醛，0.1％Triton X_100的HEPES缓冲液)固定1 h。20 μg/L的Hochest33258用HEPES缓冲液配制，室温下避光染色过夜。荧光显微镜下观察原核。

1.2.3　Western Blotting法检测CyclinB2、Mos、p_ERK1表达

　　挑选MII期细胞，2.5 μmol/L钙离子载体A23187诱导激活，分别于加入激活剂后0、10、30、60 min收集细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗。按照每个细胞5 μl的量加入裂解缓冲液(50 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，0.1％ NP_40，0.5％脱氧胆酸，临用时加入PMSF和磷酸酶抑制剂)提取蛋白。Bradford法测定蛋白浓度。蛋白样品与等体积上样缓冲液混合，100 ℃处理5 min，待样品冷却后，采用等体积上样，用10％SDS_PAGE凝胶电泳进行蛋白分离。分离后的蛋白转印至PVDF膜上，1％牛血清白蛋白(BSA)封闭，加适当滴度相应蛋白抗体，4 ℃孵育过夜。再加入与检测的蛋白相对应的碱性磷酸酶标记的二抗，37 ℃孵育1 h，显色并拍照。检测的蛋白包括CyclinB2、Mos、p_ERK1/ERK1。根据蛋白条带变化情况，确定TGA处理对以上蛋白表达影响的时间点。

　　经TGA处理的细胞在加入激活剂后1 h收集，用上述方法提取蛋白并进行Western Blotting 检测分析。

1.3　统计学方法

　　应用SPSS16.0统计学软件，对统计数据进行ANOVA和Chi_square 检验，以α=0.05为检验水准。

2　结　果

2.1　TGA对非洲爪蟾卵母细胞激活率的影响

　　TGA对非洲爪蟾卵母细胞孤雌激活率的影响见表1。在加入激活剂之后的各个时间点计数并计算激活率(激活率=激活细胞数/细胞总数×100％)，统计分析结果显示，除TGA 5、25 μg/ml组在激活剂作用10 min时，激活率变化不明显外，其余各记录点的激活率与对照组相比，均明显降低(P<0.05)。提示TGA对非洲爪蟾卵母细胞的孤雌激活具有抑制作用。

2.2　爪蟾卵母细胞激活过程中细胞形态和细胞核的变化

　　成熟卵母细胞给予钙离子载体A23187诱导激活，卵母细胞动物极缩小，呈现“戴帽”现象，如图1所示，对照组所形成的黑斑形状规整，边缘整齐；而TGA处理的细胞则表现为黑斑周围毛糙不齐，细胞激活表现不明显。

　　卵母细胞完成第二次成熟分裂后，一组染色体重组形成卵核，后增大成为雌原核。如图2所示，未经TGA处理的细胞激活后形成一清晰的原核，而此现象在125 μg/ml TGA组则未能观察到。

2.3　TGA对非洲爪蟾卵母细胞孤雌激活过程中MPF和MAPK信号通路的影响

　　未经TGA处理的卵母细胞在加入激活剂后不同时间MPF和MAPK的变化见图3。在加入激活剂后，CyclinB2、p_ERK1和Mos都迅速降解消失。其中p_ERK1蛋白和Mos蛋白在激活后60 min完全消失，据此确定后期检测TGA对MPF和MAPK影响的时间点为加入激活剂后的60 min。

　　如图4所示，在钙离子载体A23187诱导激活1 h后，在TGA 125 μg/ml处理组，CyclinB2 ，p_ERK1蛋白表达水平明显高于对照组。TGA 25和125 μg/ml处理组明显抑制孤雌激活过程Mos的降解。

3　讨　论

　　巯基乙酸作为冷烫精的主要成分，其毒性作用已经有很多国内外学者做过研究。TGA可以通过皮肤、胃肠道和呼吸道吸收[7－8]。有研究表明，TGA具有生殖毒性，它可以干扰人类月经周期，引起月经紊乱[9]，在TGA染毒的大鼠和小鼠，可以观察到其卵巢和睾丸的病理结构改变[7－8]。本课题组前期研究表明，TGA可以干扰小鼠卵母细胞成熟过程中纺锤体的形成和染色体的正常排列，而且对第一极体的排出也有抑制作用[2]。在爪蟾卵母细胞体外成熟过程中，TGA染毒可以促进细胞生发泡破裂，但抑制第一极体排出和MII期成熟赤道板的形成[3]。

　　非洲爪蟾是一种广泛用于发育生物学和生态毒理学研究的动物模型，其卵细胞数量多且体积大，能极大满足实验需求。因此，本实验选择非洲爪蟾为实验动物，研究TGA对卵母细胞孤雌激活的影响，并检测MPF和MAPK相关蛋白，从分子水平探讨其作用机制，为明确TGA的生殖毒性提供实验依据，有着重要的理论和实际意义。在卵母细胞的成熟过程中，有多种生化因素参与其精细而复杂的调控。其中，MAPK和MPF被认为是调控卵母细胞成熟过程时间特异性和空间特异性的关键因子[10－11]。

　　生发泡期(GV期)的卵母细胞在孕酮诱导下发生GVBD，并进入MI期，排出第一极体后进入并停滞于MII期，直至受精或孤雌激活后排出第二极体。爪蟾卵母细胞在给予激活剂诱导之后，细胞内游离钙离子浓度发生脉冲式升高，细胞动物极迅速缩小，称之为激动波。许多动物卵母细胞胞质和皮层中含有色素颗粒，受精后色素颗粒均转移到皮层中[12]。在加入激活剂后，可观察到细胞动物极颜色逐渐加深，直至最后形成一圆形深色受精斑。为进一步确定激活情况，我们对细胞进行荧光染色，观察是否有原核的形成。结果提示，TGA处理抑制了原核的形成，推测其可能原因为MAPK的降解，而在多种激活剂诱导的孤雌激活中，原核形成之前均发生MAPK失活，提示MAPK的失活是受精后原核核膜组装的必要条件[13－15]。

　　MPF由其调节亚基细胞周期蛋白CyclinB和催化亚基细胞周期蛋白依赖性激酶_1(CDK_1，又称Cdc2)组成。MPF的活性在细胞受精或激活后迅速下降，这是卵母细胞突破MII期阻滞的一个必要条件，而MPF的失活需要CyclinB的泛素途径降解[16]，本课题检测TGA处理后卵母细胞中CyclinB2蛋白的表达水平，以间接反映MPF的活性变化。研究结果显示，TGA 125 μg/ml处理可以使孤雌激活后卵母细胞中CyclinB2的蛋白表达水平升高，提示MPF在激活中的作用受到抑制。

　　CyclinB的减少可以使MPF的活性下降，这是MII期卵母细胞激活的必要条件，而MPF的作用与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是相互的。MAPK又称细胞外调节激酶(ERK)，是一种Ser/Thr蛋白激酶家族。MAPK的活化涉及一系列蛋白的级联磷酸化激活，其组成为MAPKKK(MEEK)_MAPKK(MEK)_MAPK_P90RSK。MAPKKK的代表为Mos，是一个由原癌基因c_mos编码的39 ku的Ser/Thr蛋白激酶。有研究表明c_mos基因敲除的小鼠卵母细胞可以自发发生孤雌激活而不发生MII期阻滞[17]。同时，Mos是细胞静止因子(cytostatic factor，CSF)的主要成员，CSF存在于脊椎动物卵母细胞，它与MPF共同作用，可以使卵母细胞减数分裂阻滞于MII期[18]。而Mos同时又是MAPK通路的上游分子， Hideki[19]在用电激活猪卵母细胞时发现，MAPK抑制剂U0126可以诱导细胞突破MII期阻滞。我们的研究结果表明，25和125 μg/ml TGA均可以抑制Mos的降解。在对其下游分子p_ERK的检测中发现25 μg/ml TGA对其蛋白表达水平有显著影响。因此，我们推测，TGA处理影响了Mos的表达水平，进而一方面影响其下游信号蛋白p_ERK的表达，另一方面阻止了CSF的失活，从而导致CyclinB的降解受到抑制。

　　综上，本次研究结果表明小剂量(≤25 μg/ml)TGA可能对CyclinB和p_ERK的表达没有明显作用，甚至对Mos的降解有轻微的促进作用，但是当达到一定剂量(125 μg/ml)时对以上3种蛋白的降解均起到抑制作用。提示TGA对生殖功能有一定的毒性作用，建议加强对TGA接触者的保护措施，育龄男女更应该减少接触TGA的机会。

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收稿日期： 2010－05－28； 修订日期： 2010－06－30

基金项目： 国家自然科学基金资助课题(30400356).

作者简介： 任晓梅(1985－　)，女，陕西省渭南人，硕士研究生，研究方向：生殖毒理学。

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