李　巍1,2/李海洲2/李福才1,

(1. 中国医科大学基础医学院医学遗传学教研室,辽宁 沈阳 110001；2. 锦州市中心医院，辽宁 锦州 121000)

PIN1 gene amplification and overexpression in human laryngeal squamous cell carcinoma

LI Wei1，2, LI Hai_zhou2, LI Fu_cai1,

(1. Department of Medical Genetics, China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning; 2. Jinzhou Central Hospital, Jinzhou 121000, Liaoning, China)

　　【摘要】 目的： 研究PIN1基因在喉癌组织中的表达情况。方法： 采用差异PCR、核型分析方法检测喉鳞癌及癌旁对照组织中PIN1基因扩增情况；采用RT－PCR检测同批组织中PIN1 mRNA表达情况；采用免疫组织化学、Western Blot方法检测PIN1蛋白表达情况。 结果： 与癌旁对照组织相比，40例喉癌组织中有9例(9/40，22.5％)存在PIN1基因扩增，27例(27/40，67.5％)PIN1 mRNA过表达，26例(26/40，65％)PIN1蛋白过表达(P<0.05)。40例中17例原代培养成功，可制备中期染色体标本，其中3例(3/17，17.65％)存在19号染色体增加。 结论： 喉鳞状细胞中PIN1基因拷贝数增加，PIN1 mRNA和蛋白质过表达，可能与喉癌发生发展有关。

　　【关键词】 喉鳞状细胞癌； PIN1基因； 基因扩增； 过表达

　　中图分类号： R739.65　　　　文献标识码： A　　　　文章编号： 1004－616X(2010)05－0366－04

　　【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To investigate the amplification and overexpression of PIN1 gene in human laryngeal squamous cell carcinoma. METHODS: PIN1 gene amplification(increase of gene copy number) was detected by differential PCR and Karyotype analysis. PIN1 mRNA was evaluated by RT_PCR. Furthermore, immunohistochemistry and Western Blot were employed to detect the PIN1 protein. RESULTS: Compared with nomal control, PIN1 gene amplification rate was 22.5％(9/40), while 17.65％(3/17) was found to have an increase of chromosome 19; the rate of mRNA overexpression was 67.5％(27/40). PIN1 protein was obviously upregulated, the ratio was 65％(26/40)(P<0.05). CONCLUSION: PIN1 gene copy increased, with mRNA and protein overexpression in laryngeal carcinoma. This fact may be relevant to laryngeal cancer development.

　　【KEY WORDS】 laryngeal squamous cell carcinoma; PIN1 gene; gene amplification; overexpression

　　肽基脯氨酰顺反式异构酶1(peptidyl_prolyl cis/trans isomerase 1,PIN1)是高度保守的、特异的磷酸化异构酶，仅作用于磷酸化的丝氨酸/苏氨酸_脯氨酰键。PIN1基因过表达会导致中心体扩增，细胞有丝分裂异常，染色体不稳定，进而引起细胞转化和肿瘤发生[1－2]。Lere Bao等报道[3]，PIN1基因在多种肿瘤中过表达，如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、子宫颈癌等，而PIN1基因在喉癌中的表达情况至今未见报道。因此，我们利用差异PCR方法，核型分析方法，RT_PCR，免疫组化和Western Blot方法检测PIN1基因在喉鳞状细胞癌中的表达变化，探讨其在喉癌发生、发展中的作用。

1　材料与方法

1.1　材料

　　40例喉鳞状细胞癌标本均来自于中国医科大学附属第一医院耳鼻喉科，患者均经病理诊断为喉鳞状细胞癌，术前未经过放化疗，其中男性23例，女性17例，年龄41～79岁，平均61.9岁，取距癌巢2 cm以上的组织作为正常对照。

1.2　试剂和仪器

　　Trizol Reagent(Invitrogen)，反转录试剂盒,Taq酶(TaKaRa)，兔抗人PIN1蛋白多克隆抗体(Santa Cruz)，甲叉双丙烯酰胺(MERCK),PRMI 1640培养基，标准胎牛血清，秋水仙素，PCR扩增仪(Biometra),电泳仪(BIO_RAD),凝胶成像及分析系统(UVP),染色体自动分析仪(Leica)。

1.3　PIN1基因表达分析

　　应用Primer premier5软件设计PIN1 DNA和PIN1 mRNA扩增引物(序列见表1)，引物序列由上海生物工程公司合成。取100 mg喉癌及癌旁对照组织(距癌巢2 cm以上组织)，应用酚_氯仿法提取DNA，紫外分光光度计检测DNA纯度，要求D(260)/D(280)≈1.8，以β_actin为内参照，差异PCR反应条件为95 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，59 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35个循环，72 ℃延伸10 min。取5 μl产物进行琼脂糖凝胶电泳，用UVP成像系统采集图像，Labworks软件测量电泳条带积分光密度，分析PIN1基因扩增情况。用如下公式计算基因扩增倍数：

　　取喉癌、癌旁对照组织各100 mg，常规方法提取总RNA，紫外分光光度计检测RNA纯度D(260)/D(280)为1.9～2.0，cDNA合成按反转录试剂盒(TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0)说明进行。PCR 扩增条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，反应35个循环，72 ℃延伸10 min，以β_actin为内参照。取5 μl产物进行电泳，UVP凝胶成像系统拍照并用其系统软件Labworks测量电泳条带积分光密度，分析PIN1在肿瘤和癌旁组织中的表达情况。

1.4　免疫组化检测喉癌组织中PIN1蛋白表达

　　取喉癌组织和癌旁对照组织各100 mg，制备10 μm冰冻切片，4 ℃预冷丙酮固定20 min，自然晾干，按试剂盒(福州迈新生物技术有限公司Kit_9106)说明书进行S_P法免疫组化实验，一抗兔抗人PIN1蛋白多克隆抗体(美国Santa Cruz公司，SC_15340)稀释比例1:200，室温孵育4 h。DAB染色，甲基绿复染，中性树胶封片并拍照，采用Metamorph offline软件进行结果分析。

1.5　Western Blot法检测喉癌组织中PIN1蛋白表达

　　提取喉癌组织和癌旁对照组织总蛋白，用考马斯亮蓝法定量分析蛋白含量，以β_actin为内参照，比较喉癌组织及癌旁对照组织中PIN1蛋白的表达水平。将蛋白上样于12％的SDS_PAGE胶中进行电泳，之后用转印槽转移蛋白至0.2 μm孔径的PVDF膜上，以5％脱脂奶粉封闭，加入1:1 000稀释的兔抗人PIN1多克隆抗体(美国Santa Cruz公司，sc_15340)室温孵育4 h，再加入辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG(1:10 000)(北京中杉金桥生物技术有限公司，ZB_2031)室温孵育2 h，ECL化学发光试剂显影。应用UVP凝胶成像系统对实验结果进行扫描分析。

1.6　喉癌组织原代细胞培养及核型分析

　　喉癌组织成纤维成分含量高，故采用改良法[4]进行原代细胞培养，取新鲜喉癌术后标本置于4 ℃肿瘤转移液中(Hanks液，2 μg/ml氟康唑，100 U双抗)，剔除血管、软骨等非肿瘤组织。将剪碎的喉癌组织置于培养瓶中，加入消化液(RPMI 1640含双抗，8％胎牛血清，1 mg/ml胶原酶)，37 ℃孵育16 h。离心收集细胞，加入RPMI 1640培养液(含双抗，8％胎牛血清,2 U/ml胰岛素)。将细胞接种至铺有3％明胶的培养皿中，37 ℃、 CO2 孵箱培养。待培养皿中细胞覆盖率达60％时，加入秋水仙素(0.8 μg/ml)，继续培养2～3 h收获细胞。常规制备染色体标本，G显带后应用Leica染色体自动分析系统进行核型分析。以癌旁2 cm组织为对照，操作方法同前。

1.7　统计学分析

　　所有数据均采用SPSS13.0软件进行统计学处理。其中喉癌组和癌旁对照组差异PCR结果应用卡方检验；RT_PCR、免疫组化、Western Blot结果应用配对资料t检验，每个病例的癌组织和癌旁对照组织进行配对。以α=0.05为检验水准。

2　结　果

2.1　喉癌组织中PIN1基因表达变化

　　340 bp处为PIN1 DNA扩增条带，507 bp处为内对照β_actin扩增条带，癌旁对照组织中PIN1和β_actin DNA表达积分光密度之比的平均值<2.0(1.75±0.24)，以DNA扩增倍数>2.0为PIN1基因扩增阳性，喉癌组中有9例(9/40，22.5％)存在PIN1基因异常扩增(χ2= 29.032, P<0.05)(图1A)。同样，喉癌组织中有27例(27/40，67.5％)PIN1 mRNA过表达，喉癌组织PIN1 mRNA表达的平均积分光密度为927.037±84.570，癌旁对照组织中为565.910±84.812，经配对资料t检验，两者之间差异有统计学意义(t=3.412，P<0.05)(图1B)。

2.2　喉癌组织中PIN1蛋白表达变化

　　免疫组化结果显示，喉癌组织中PIN1蛋白表达阳性区主要集中在细胞质(呈棕黄色)；正常对照细胞未见明显PIN1蛋白表达阳性区。采用Metamorph offline软件进行图像分析结果显示，喉癌组织PIN1阳性区域的平均积分光密度为135.74±0.25，癌旁对照组织为45.36±0.75，对数据进行配对资料t检验，差异有统计学意义(t=4.516，P<0.05)(图2A、2B)。Western Blot分析结果显示，肿瘤组织PIN1蛋白的平均积分光密度为1 342.096±72.340，癌旁对照组织为327.740± 67.547，对数据进行配对资料t检验，差异有统计学意义(t= 5.372，P<0.05)(图2C)。Western blot检测结果发现喉癌中PIN1蛋白过表达。从表达增加30％作为标准，26例(26/40，65％)过表达(χ2=38.519,P<0.05)。

2.3　喉癌组织原代细胞培养及核型分析

　　40例喉癌组织经原代细胞培养，有17例培养成功，癌旁对照组织中12例培养成功，细胞贴壁生长、分裂增殖，制备出可供分析的中期染色体标本，G显带核型分析显示(图3A,3B)，每个病例随机计数10个核型(共统计170个核型)，喉癌组织细胞核型染色体数为48～108，众数为61～68条，其中有3例(3/17，17.65％）发现19号染色体增加，数目为3～4条，癌旁对照细胞核型染色体数为46条，19号染色体数为2条。

3　讨　论

　　PIN1是人类的肽基脯氨酰异构酶，定位于19p13，cDNA 全长为997 bp，由163个氨基酸组成。PIN1蛋白N端为色氨酸_色氨酸中心区(W_W)，介导PIN1与底物中磷酸化的Ser/Thr_Pro基序特异性结合；C端为肽基脯氨酰异构酶活性区，可催化已磷酸化的Ser/Thr_Pro发生顺反异构使底物发挥功能[1,5]，影响蛋白质活性、相互作用及亚细胞定位[6]。PIN1与细胞周期调控高度相关，通过多种机制诱导细胞增殖和抑制细胞凋亡，导致肿瘤的发生[7]。大量研究表明人类的前列腺癌、甲状腺癌、肝癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中PIN1存在过表达[3,8]，在宫颈正常组织、宫颈上皮内瘤变及宫颈癌中PIN1的表达逐步升高[9]，而对于PIN1在喉癌中的表达情况至今尚未见报道。

　　本研究中我们应用RT_PCR、免疫组化及Western Blot方法在喉鳞状细胞癌组织中检测PIN1 mRNA及蛋白质表达水平，结果均发现PIN1过表达，这与口腔上皮鳞癌[10]、甲状腺乳头状癌及滤泡状癌[11]中呈现过度表达的结果相一致。本研究中我们还发现在喉鳞状细胞癌中，PIN1基因的拷贝数较正常组织增加，PIN1基因所在的19号染色体亦有数目增加的现象，这可能与喉鳞状细胞癌中PIN1基因过表达有关。

　　Suizu等[2]的研究显示PIN1过表达可促使中心体异常，染色体不稳定和肿瘤发生。我们发现喉癌中PIN1存在过表达，前期研究表明喉癌细胞系和实体瘤中存在中心体扩增[12]，因此认为喉癌中PIN1可能通过促使中心体的异常扩增，染色体不稳定而在喉癌的发生发展中起作用；反之，染色体数目增加及基因扩增又可能与喉癌PIN1过表达有关，如此恶性循环，促进了喉癌的发生及发展。

　　此外，Ayala等[13]研究发现前列腺癌中PIN1的表达与前列腺癌的临床分期呈正相关，Wulf等[8]报道PIN1在乳腺癌组织及细胞株中过表达且与病理分级密切相关，而我们的研究结果发现PIN1的表达情况与喉癌的临床分期及有无淋巴结转移无明显相关性，这与Ayala和Wulf等人的研究结果不一致，可能与我们的样本量较小或PIN1在喉癌发生发展的早期即过表达而发挥重要作用有关。在下一步研究中，我们将进一步扩大样本量，并完善病例的临床资料，长期随访，以进一步对PIN1检测的临床应用及其意义提供科学依据。

　　综上所述，在喉鳞状细胞癌中PIN1过表达，肿瘤细胞基因组不稳定是其分子基础之一，PIN1可以作为早期诊断喉鳞状细胞癌的分子标志物，但对其作为判断喉癌预后的价值尚需进一步研究。

参考文献

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收稿日期： 2010－01－18； 修订日期： 2010－06－06

基金项目： 辽宁省自然科学基金资助项目(2001101039)

作者简介： 李　巍(1981－　)，女，辽宁锦州人，硕士，医师，研究方向：肿瘤的分子与细胞遗传学。

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