宋振川1/王　磊1/郭宸君1/李　勇1,/檀碧波2/范立侨1

(1.河北医科大学第四医院外三科， 河北 石家庄 050011; 2. 河北省人民医院外二科，河北石家庄 050011)

Expression of 4_1BB in different gastric cancer cell lines

SONG Zhen_chuan1,WANG Lei1,GUO Chen_jun1,LI Yong1,,TAN Bi_bo2, FAN Li_qiao1

(1. Third Department of Surgery, The Fourth Affiliated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, Hebei；2. Second Department of Surgery, The Peoples' Hospital of Hebei Province. Shijiazhuang 050011 Hebei, China)

　　【摘要】 目的： 研究共刺激因子4_1BB在人胃高分化腺癌细胞株MKN_28、人胃中分化腺癌细胞株SGC_7901、人胃低分化腺癌细胞株BGC_823、人胃粘液腺癌细胞株MGC_803中的表达及其生物学意义。 方法： 用RT_PCR法测定胃癌细胞株中4_1BB mRNA表达；免疫细胞化学法测定胃癌细胞株中4_1BB蛋白表达；MTT法测定人淋巴细胞对胃癌细胞的体外杀伤活性；ELISA法检测人淋巴细胞与胃癌细胞共培养上清液中IL_2、IL_10、TNF_α的含量。 结果： RT_PCR结果示4_1BB mRNA表达率从高到低依次为：MGC_803(77.30％)、BGC_823(71.68％)、SGC_7901(40.06％)、MKN_28(37.65％)。免疫细胞化学结果显示4_1BB着色程度由深到浅依次为：MGC_803、BGC_823、SGC_7901、MKN_28。MTT结果显示各时间段(24、48、72 h)不同效靶比(10∶1，20∶1，40，∶1)下，人淋巴细胞对胃癌细胞的体外杀伤活性由高到低的顺序为：MKN_28、SGC_7901、BGC_823、MGC_803。ELISA结果显示在各效靶细胞比下，人淋巴细胞与胃癌细胞共培养上清液中IL_2、 TNF_α的含量由高到低的顺序均为: MKN_28、SGC_7901、BGC_823、MGC_803。而IL_10的含量由高到低的顺序为: MGC_803、BGC_823、SGC_7901、 MKN_28。 结论： 人胃癌细胞株MKN_28、SGC_7901、BGC_823、MGC_803中4_1BB基因的mRNA 和蛋白均有表达，且胃癌细胞株的恶性程度越高其4_1BB表达水平越高；淋巴细胞对低表达4_1BB胃癌细胞的杀伤力较高；提示4_1BB可能通过抑制细胞因子 TNF_α、IL_2和促进细胞因子IL_10的产生调节肿瘤免疫。

　　【关键词】 胃癌细胞株； 肿瘤免疫； 4_1BB

　　中图分类号: R735.2　　　　文献标识码: A　　　　文章编号： 1004－616X(2010)05－0370－04

　　【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To study the expression of 4_1BB and its biological function in different human gastric cancer cell lines. METHODS: The expression of 4_1BB in different human gastric cancer cell lines was detected by immunohistochemical technique and reverse transcription polymerase chain reaction (RT_PCR). The killing activity of lymphocytes against gastric cancer cell lines was detected by MTT, whilst IL_2,IL_10,TNF_α were tested in the supernatant by ELISA. RESULTS: RT_PCR analysis showed that the 4_1BB mRNA expressions were MGC_803 (77.30％),BGC_823 (71.68％),SGC_7901(40.06％) and MKN_28(37.65％) in decreasing order. The 4_1BB protein expressions were MGC_803, BGC_823, SGC_7901 and MKN_28 in decreasing order by cytoimmunochemistry staining. MTT analysis showed that the killing activities from high to low were MKN_28, SGC_7901, BGC_823 and MGC_803. ELISA analysis showed that IL_2 and TNF_α levels were MKN_28, SGC_7901, BGC_823 and MGC_803 and IL_10 level was MGC_803,BGC_823, SGC_7901 and MKN_28, from high to low. CONCLUSION: The four different gastric cancer cell lines all expressed 4_1BB at mRNA and protein levels. The 4_1BB expression level related to gastric cancer cell lines to different degrees. The killing activity of lymphocytes against gastric cancer cell lines increased with decreasing 4_1BB expression. 4_1BB could regulate tumor immunity by inhibiting cell factors TNF_α and IL_2 and promoting cell factor IL_10.

　　【KEY WORDS】 gastric cancer cell lines； tumor immunity； 4_1BB

　　4_1BB分子是肿瘤坏死因子受体超家族成员之一，主要表达在活化T细胞上，以CD8＋T细胞为主，亦可表达于单核细胞、粒细胞及树突状细胞等细胞，其生物学功能主要是促进T细胞活化、增殖，分泌细胞因子，而且在T细胞反应的后期维持T细胞的生存及免疫记忆应答中起重要作用，因此4_1BB对激活肿瘤特异性CTL和维持机体长久的抗肿瘤效应至关重要[1]。本实验采用RT_PCR和免疫细胞化学法检测不同分化程度的人胃癌细胞株4_1BB的mRNA和蛋白表达，采用四甲基噻唑蓝(MTT)法测定人淋巴细胞对人胃癌细胞株的体外杀伤活性，酶联免疫吸附(ELISA)法检测人淋巴细胞与胃癌细胞共培养的上清液中TNF_α、IL_2、IL_10的含量变化，探讨4_1BB的表达与胃癌免疫之间的关系。

1　材料与方法

1.1　细胞株

　　人胃高分化腺癌细胞株MKN_28购于重庆医科大学；人胃中分化腺癌细胞株SGC_7901、人胃粘液腺癌细胞株MGC_803购于中国科学院上海细胞生物研究所；人胃低分化腺癌细胞株BGC_823由河北医科大学第四医院科研中心保存。

1.2　方法

1.2.1　RT_PCR方法检测人胃癌细胞株中4_1BB mRNA的表达　分别提取4种胃癌细胞总RNA，用RT_PCR试剂盒进行检测，4_1BB上游引物序列：5′_GTTTCACTTGCACTGCACCTGCAGC_3′，下游引物序列：5′_TATCAAGGTCCAACTTGGGGAAGG_3′。反应条件：95 ℃ 5 min预变性；95 ℃ 2 min，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，38个循环；72 ℃延伸5 min，产物为465 bp。用目的基因与内参照基因(β_actin)两电泳条带的单位面积内的光密度灰度比值来反映目的基因的相对表达水平，其相对表达水平按下式计算。

　　目的基因相对表达水平=(目的基因灰度值－背景灰度值)/(内参照基因灰度值－背景灰度值)

1.2.2　免疫细胞化学法检测胃癌细胞株中4_1BB蛋白的表达　常规细胞铺片，4 ℃下4％多聚甲醛固定1 h；3％甲醇_双氧水湿盒内室温孵育10 min；滴加山羊血清湿盒内室温孵育10 min；滴加一抗(鼠抗人4_1BBL单克隆抗体，稀释度为∶1∶50)湿盒内过夜；滴加二抗，湿盒孵育1 h；滴加三抗，湿盒孵育45 min；DAB显色；苏木素复染；脱水透明，中性树胶封片，摄片。

1.2.3　外周血人淋巴细胞分离　无菌操作抽取健康志愿者静脉血10 ml于真空采血管中(内含肝素)，与等量PBS混合，缓慢滴入含等量淋巴细胞分离液的离心管中。2 000 r/min离心15 min，收集白色淋巴细胞层。以含10％小牛血清的RPMI1640培养基重新悬浮细胞，在37 ℃、5％ CO2条件孵箱中静置4 h，收集非贴壁的淋巴细胞，调整到试验所需的细胞浓度。

1.2.4　MTT法检测人淋巴细胞对4种胃癌细胞的杀伤活性　取处于对数生长期的胃癌细胞，0.25％胰蛋白酶消化，以每孔5×103个细胞接种于96孔培养板中，每孔100 μl。待细胞贴壁稳定后加入淋巴细胞，浓度分别调整为5×105/ml、1×106/ml、2×106/ml，每孔体积100 μl。实验分为实验组、效应细胞组和靶细胞组，共3组。每组3个复孔。实验组又细分为4种胃癌细胞分别加入淋巴细胞的各组。效应细胞组为单独的淋巴细胞。靶细胞组为单独的胃癌细胞。将培养板在37 ℃、5％ CO2及饱和湿度二氧化碳孵箱分别培养24、48、72 h终止培养，每孔加入20 μl (5 mg/ml) MTT，37 ℃孵育4 h，弃上清液，每孔加入150 μl DMSO 振荡10 min，酶联免疫检测仪(波长490 nm)检测D(490) nm值。按以下公式计算杀伤率，每组实验数据重复3次。

　　杀伤活性(％)={1－[实验组D(490)值－单独效应细胞组D(490)值)]/单独靶细胞D(490)值}×100％

1.2.5　IL_2、 IL_10、TNF_α含量的测定　胃癌细胞与淋巴细胞共培养上清液中IL_2、 IL_10、TNF_α含量采用ELISA法测定。胃癌细胞与淋巴细胞共培养步骤同1.2.4培养48 h后收获上清液。保存于－80 ℃冰箱备用。实验操作严格按照说明书操作。

1.2.6  统计学方法  用SPSS 16.0统计软件分析数据，组间比较用方差分析，以α=0.05为检验水准。

2　结　果

2.1　胃癌细胞株4_1BB mRNA的半定量结果　

　　如图1所示，几种胃癌细胞株中4_1BB mRNA的表达率分别为：MGC_803，77.30％；BGC_823，71.68％；SGC_7901，40.06％； MKN_28，37.65％。

2.2　免疫细胞化学检测结果 

　　结果见图2。图2示BGC_823、SGC_7901、MGC_803、MKN_28细胞膜、胞浆均有4_1BB阳性表达。4_1BB着色程度由深到浅依次为：MGC_803、 BGC_823、SGC_7901、MKN_28。

2.3　MTT法检测人淋巴细胞对胃癌细胞的体外杀伤活性 

　　结果见表1。淋巴细胞对4种胃癌细胞的杀伤活性均在72 h最高，且随效细胞∶靶细胞比例的增高而增强，在各时段对MKN_28和SGC_7901的杀伤率均明显高于BGC_823和MGC_803(P<0.05)。

2.4　ELISA法检测结果

　　结果见表2。相同的效应细胞∶靶细胞时，TNF_α、IL_2的含量由高到低依次为:MKN_28、SGC_7901、BGC_823、MGC_803。而IL_10的含量由高到低依次为: MGC_803、BGC_823、SGC_7901、 MKN_28。

3　讨　论

　　4_1BB属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，是重要的共刺激分子，在T细胞的活化过程中起着非常重要的作用。4_1BB (CD137) 表达于活化后的T细胞、树突状细胞、NK细胞,并持续表达于人血液中性粒细胞[2]。4_1BB分子在非免疫细胞表面也有表达。恶性肿瘤血管内皮细胞表面高表达4_1BB分子[3]。部分肿瘤细胞系如骨肉瘤细胞系Saos_2中也可以检测到4_1BB的表达[4]。本实验采用RT_PCR和免疫细胞化学法测定4种不同分化程度人胃癌细胞株中4_1BB的表达，RT_PCR结果显示4_1BB mRNA的表达由高到低为：粘液腺癌细胞MGC_803 、低分化腺癌细胞BGC_823、中分化腺癌细胞SGC_7901、高分化腺癌细胞MKN_28；免疫细胞化学法检测显示4_1BB着色程度由深到浅依次为：粘液腺癌细胞MGC_803、低分化腺癌细胞BGC_823、中分化腺癌细胞SGC_7901、高分化腺癌细胞MKN_28 ，与RT_PCR方法结果一致。由此可见随着肿瘤分化程度的提高4_1BB的表达逐渐降低。

　　人体的抗肿瘤免疫是以T细胞介导的细胞免疫为主，T细胞的活化需要两个信号的参与:一是TCR接受抗原递呈细胞传导的MHC_抗原肽信号；另一个是细胞膜表面黏附分子提供的协同刺激信号(或称第二信号)。CD28/B7协同刺激信号主要在T细胞活化前期起作用,促进其增殖并维持其短期的存活；而4_1BB/4_1BBL结合产生的协同刺激信号主要作用于应答晚期,能协同CD28进一步活化T细胞,并分泌高水平的IL_2[5]。4_1BB/4_1BBL信号途径还能促进CD8＋细胞毒性T细胞活化、增殖并增强其细胞毒作用,同时还能保护CD8＋T细胞免于活化诱导的细胞死亡[6]。张利永等[7]采用细胞共培养技术，用活化的内皮细胞与活化的T细胞共培养，活化的内皮细胞诱导表达的4_1BB与活化的T细胞诱导表达的4_1BBL相互作用，通过4_1BBL向T细胞内传递抑制信号，抑制了T细胞合成和分泌细胞因子的功能。本研究应用MTT法测定人淋巴细胞对上述4种胃癌细胞的杀伤活性时发现，淋巴细胞对4_1BB 表达较低的高分化腺癌细胞株MKN_28和中分化腺癌细胞株SGC_7901的杀伤力明显高于粘液腺癌细胞株MGC_803和低分化腺癌细胞株BGC_823，提示4_1BB高表达抑制了淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的能力。用 ELISA法检测淋巴细胞与胃癌细胞株共培养上清液的IL_2、TNF_α含量发现，4_1BB 表达较低的MKN_28和SGC_7901组IL_2、TNF_α的含量高于4_1BB高表达的MGC_803和BGC_823,而IL_10含量由高到低依次为：MGC_803，BGC_823， SGC_7901 ，MKN_28，其结果也提示4_1BB的高表达抑制促免疫细胞因子IL_2、TNF_α的分泌，促进免疫抑制细胞因子IL_10的分泌。

　　综上所述，在不同分化的胃癌细胞株中，随胃癌细胞株的恶性程度越高4_1BB表达水平越高; 4_1BB表达越高则分泌免疫因子IL_2、TNF_α越低、而免疫抑制因子越高。推测表达于胃癌细胞株的4_1BB可以抑制部分活化的T细胞的合成和分泌，进一步减弱肿瘤免疫，使肿瘤细胞得以存活及快速生长，具体机制还有待于进一步的研究。

参考文献

[1] Kwon B, Lee HW, Kwon BS, et al. New insights into the role of 4_1BB in immune responses: beyomd CD8＋ T cells[J]. Trends Immunol, 2002,23(8):378－380.

[2] Croft M. Co_stimulatory members of the TNFR family: keys to effective T cell immunity? [J]. Nat Rev Immunol， 2003,3(8):609－620.

[3] Qun W, Pin ZH, Qixia ZH, et al. Analysis of CD137 and CD137L expression in human primary tumor tissues[J]. Croat Med J, 2008, 49(2): 192－200.

[4] Lisignoli G,Toneguzzi S,Cattini L,et al.Different expression pattern of cytokine receptors by human osteosarcoma cel1 lines[J]. Int J Oncol,1998,2(4):899－903.

[5] Bertram EM, Lau P,Watts TH,et al.Temporal segregation of 4_1BB versus CD28_mediated costimulation[J]. J Immunol, 2002,168(5): 3777－3785.

[6] Mittler RS, Foell J,Mc Causland M,et al.Anti_CD137 anti_bodies in the treatment of autoimmune diseases and cancer[J]. Immunol Res, 2004, 29(1/2/3): 197－208.

[7] 张利永，黄　钢，傅晓岚.内皮细胞表达CD137分子介导对T细胞的抑制效应[J].第三军医大学学报，2005,27(15):1541－1543.

收稿日期： 2010－03－29； 修订日期： 2010－06－02

基金项目： 河北省自然科学基金(C2008000966)，河北省普通高校强势特色学科资助项目(冀教高[2005]52)

作者简介： 宋振川(1964－　)男，河北大名县人，博士，主任医师，研究方向：胃癌及乳腺癌的基础与临床研究

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