刘月峰/徐新云/李学余/周　丽/袁建辉/杨细飞/杨淋清

(深圳市疾病预防控制中心, 深圳 518020)

mRNA expression of apoptosis genes in spleen and peripheral blood of guinea pigs treated with trichloroethylene

LIU Yue_feng, XU Xin_yun, LI Xue_yu, ZHOU Li, YUAN Jian_hui, YANG Xi_fei, YANG Lin_qing

(Shenzhen Center for Disease Control and Prevention, Shenzhen 518020, China)

　　【摘要】 目的： 探讨三氯乙烯(trichloroethylene, TCE)对豚鼠脾和外周血淋巴细胞凋亡基因Bcl_2、BAX、BAD mRNA表达的影响。方法： 采用豚鼠最大值法(guinea pig maximization test, GPMT)将18只豚鼠随机分为TCE实验组、阴性对照组、阳性对照组，共3组，每组6只。实验采用皮内注射的方式致敏，TCE实验组注射5％ TCE(TCE∶橄榄油=5∶95)，阳性对照组注射0.125％ 2，4_二硝基氯苯(2,4_dinitrochlorobenzene, DNCB)和福氏完全佐剂(Freund's adjuvant complete, FCA)等量混合物，阴性对照组注射橄榄油。各组于第1天皮内注射受试物致敏，第8天用受试物涂皮诱导，第15天涂皮激发。于第15天激发后24 h，抽取豚鼠外周血，并处死豚鼠摘取脾脏。用荧光定量PCR检测脾和外周血淋巴细胞凋亡基因Bcl_2、BAX和BAD的mRNA表达水平。 结果： 阳性对照组和TCE实验组动物均出现明显皮肤损害，TCE致豚鼠皮肤变态反应动物模型建立成功。TCE实验组和阳性对照组豚鼠脾淋巴细胞Bcl_2、BAX和BAD的mRNA表达水平均较阴性对照组显著升高(P<0.01)；但TCE实验组和阳性对照组豚鼠外周血淋巴细胞Bcl_2、BAX和BAD的mRNA表达水平与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。 结论：三氯乙烯可诱导豚鼠产生明显的皮肤变态反应，对豚鼠脾淋巴细胞凋亡基因表达水平有一定影响。

　　【关键词】 三氯乙烯； 豚鼠； 脾； 外周血； 淋巴细胞； 凋亡基因

　　中图分类号： R730.45　　　　文献标识码： A　　　　文章编号： 1004－616X(2010)05－0379－04

　　【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To study mRNA expression of apoptosis genes Bcl_2, BAX, BAD in spleen and peripheral blood of guinea pigs after treatment with trichloroethylene (TCE). METHODS: Guinea pig maximization test (GPMT) was applied in this study, 18 guinea pigs were randomly divided into 3 groups, namely negative control, positive control and TCE treatment. Animals of the 3 groups were treated with olive oil, 2,4_dinitrochlorobenzene (DNCB), and TCE, respectively, by intradermal injection. Spleens and peripheral blood were collected from the animals for mRNA expression assay, Bcl_2, BAX, BAD in lymphocytes of spleen and peripheral blood were measured by real_time fluorescent PCR assay. RESULTS: Obvious skin damage was observed in the groups of positive control and TCE treatment, the skin damage included erythema and edema. The levels of Bcl_2, BAX and BAD mRNA expression increased significantly in spleen lymphocytes in positive control and TCE treatment groups. However, the levels of Bcl_2, BAX and BAD mRNA did not elevate significantly in peripheral blood lymphocytes in positive control and TCE treatment groups, when compared with negative control. CONCLUSION: Trichloroethylene could induce skin allergic reaction in guinea pigs，it also had effects on mRNA expressions of Bcl_2, BAX, BAD in spleen lymphocytes of guinea pigs.

　　【KEY WORDS】 trichloroethylene; guinea pig; spleen; peripheral blood; lymphocytes; apoptosis gene

　　三氯乙烯(trichloroethylene，TCE)是工业上常用的有机溶剂之一，属于不饱和脂肪烃类，无色液体，易挥发。TCE主要用于清除金属制品的表面油污、清洗电路板、干洗衣物以及有机合成等。随着TCE的广泛应用，接触TCE的人群逐渐增多，TCE已成为全球最重要的有机污染物之一，广泛存在于城市大气、土壤、地表水、地下水等环境介质中。近年来常见有TCE损害工人健康[1－3]及可导致心脏、肝、肾、皮肤和神经系统损伤的报道[3－5]，但其毒作用的具体机制目前尚不清楚，因此制约了TCE职业性损害的预防控制。本实验通过观察TCE引起豚鼠的皮肤改变，并检测脾和外周血淋巴细胞的凋亡基因的表达，以探讨TCE的免疫毒性机制，为预防控制TCE的职业危害提供科学依据。

1　材料与方法

1.1　主要试剂和仪器

　　TCE纯度大于99.5％ (美国，Sigma公司)；阳性对照物2，4－二硝基氯苯(2,4_dinitrochlorobenzene, DNCB)(天津市光复精细化工研究所)；橄榄油及福氏完全佐剂(Freund's adjuvant complete, FCA)(美国，Sigma公司)；淋巴细胞分离液EZ_Sep(tm)(深圳，达科为生物技术有限公司)；70 μm nylon cell strainer(德国，BD公司)；35 mm×10 mm Dish(美国，Sigma公司)；淋巴细胞总RNA提取试剂盒Trizol Reagent(美国，Invitrogen公司)；反转录及SYBR Green Q_PCR试剂盒DRR063A(大连，宝生物公司)。凋亡基因BAX、BAD、Bcl_2的PCR引物由TaKaRa生物公司合成。MX4000型荧光定量PCR仪(美国，Stratagene公司)。

1.2　动物分组及处理

　　选择18只健康成年雌性豚鼠，体质量250～280 g，从广东省医学实验动物中心购买，随机分为TCE实验组，阳性对照组和阴性对照组，共3组，每组6只，动物自由进食饮水。采用豚鼠最大值试验GPMT (Guinea Pig maximization test)方法[6] 对各组豚鼠进行皮肤染毒。阴性对照组采用橄榄油，阳性对照组用 0.125％ DNCB和FCA等量混合物，TCE实验组用5％ TCE(TCE∶橄榄油=5∶95 )。实验第1天各组动物皮内注射受试物行第1次致敏，第8天用受试物涂皮诱导，第15天涂皮激发。于第15天激发后24 h，观察和记录受试区的皮肤反应情况，按下列标准对皮肤反应进行评分：无反应记0分，散在或小块红斑记1分，中度弥漫的红斑、轻微水肿记2分，严重红斑、水肿记3分。当受试样品组动物皮肤反应积分≥1时，判为皮肤致敏反应阳性。

1.3　脾淋巴细胞的提取

　　TCE对豚鼠皮肤致敏反应模型建立后处死动物，摘取脾脏。在35 mm平皿中加入4 ml EZ_Sep(tm) 淋巴细胞分离液，将脾脏通过70 μm细胞过滤网研磨过滤到EZ_Sep(tm) 淋巴细胞分离液中，然后将含有脾脏淋巴细胞的分离液移入15 ml离心管内，缓慢加入500 μl RPMI 1640培养基，使液面分层明显。3 000 r/min离心30 min，吸出淋巴细胞层，再加入10 ml 1640培养基，反复颠倒离心管洗涤。然后1 800 r/min离心15 min收集细胞；倾倒上清，用1 ml 1×PBS重悬细胞，移入1.5 ml 离心管内，1 200 r/min离心10 min，倾倒上清后加入1 ml Trizol，－80 ℃冰箱保存。

1.4　外周血淋巴细胞提取

　　TCE染毒动物结束后，使用抗凝管抽取豚鼠外周血2～4 ml ，用RPMI 1640培养基稀释1倍；取3 ml EZ_Sep(tm)淋巴细胞分离液置于15 ml离心管内，向该离心管内缓慢加入2～3 ml稀释的抗凝外周血，使得淋巴细胞分离液与外周血之间有明显的分层现象。其余步骤同脾淋巴细胞提取。

1.5　Bcl_2、BAX和BAD的mRNA表达水平测定

　　采用实时荧光定量PCR测定。取脾和外周血淋巴细胞，分别加入1 ml Trizol试剂，按Trizol试剂盒说明书分别提取总RNA。用RNA反转录成cDNA,按照TaKaRa公司RT_PCR 试剂盒说明书配制RT反应体系40 μl：5×PrimeScript Buffer 8 μl，PrimeScript RT Enzyme Mix×12 μl， Oligo dT Primer(50 μmol/L) 2 μl，Random 6 mers (100 μmol/L) 2 μl，总RNA 0.2 μg，加RNase Free dH2O 至40 μl。反转录条件：37 ℃ 15 min, 85 ℃ 5 s，4 ℃ 10 min， －20 ℃冰箱保存。使用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒，按照试剂盒说明书配制PCR反应体系25 μl。Bcl_2、BAX、BAD和β_actin引物序列分别为：Bcl_2,5′_ TGAACCGGCATCTGCACAC_3′(Up)，5′_CGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG_3′(Down)；BAX,5′_GCAAACTGGTGCTCAAGG_3′(Up)，5′_TTCTTCCAGATGGT GAGC_3′(Down)；BAD,5′_GCTGACGTGGACACGGAC _3′(Up)，5′_TAGTGCACAGGGCCTTGA_3′(Down)。β_actin，5′_TAAAGACCTCTATGCCAACACAG_3′(Up)，5′_CACGATG GAGGGGCCGGACTCATC_3′(Down)。反应条件是Bcl_2基因：95 ℃预变性10 s，1循环，95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s，40个循环。BAX和BAD基因：95 ℃预变性10 s，1循环；95 ℃变性5 s，58 ℃退火延伸30 s，40个循环。PCR反应结束后，以β_actin作为内参，用MX4000型荧光定量PCR分析软件仪自动计算并分析结果。

1.6　统计学方法

　　实验数据采用－±s表示，用SPSS13.0统计学软件处理数据，采用单因素方差分析(ANOVA)，以α=0.05为检验水准。

2　结　果

2.1　豚鼠皮肤致敏反应

　　用TCE对豚鼠经皮染毒，末次激发24 h后，阳性对照组动物均出现皮肤红斑及水肿反应,致敏率为100％(记分情况分别是2只动物记2分，4只动物记3分)；阴性对照组动物皮肤未出现红斑和水肿，致敏率为0；TCE实验组5只出现明显皮肤改变，致敏率为83.3％(记分情况分别是1只动物0分，1只动物1分，2只动物记2分，2只动物记3分)，TCE实验组和阴性对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.2　脾和外周血淋巴细胞Bcl_2、BAX和BAD的mRNA表达

　　结果见图1、2。阳性对照组和TCE实验组Bcl_2、BAX和BAD的mRNA表达量是以阴性对照组的表达作为1的相对表达量。结果显示，阳性对照组和TCE实验组豚鼠脾淋巴细胞Bcl_2、BAX和BAD的mRNA表达水平比阴性对照组显著升高(P<0.01)；但阳性对照组和TCE实验组豚鼠外周血淋巴细胞Bcl_2、BAX和BAD的mRNA表达水平和阴性对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

3　讨　论

　　TCE作为常用的有机溶剂之一，在工业上应用非常广泛。最近十多年时间我国广东等沿海地区常发生接触TCE引起严重皮肤和肝脏损害的病例。上世纪八、九十年代通常称之为“三氯乙烯中毒”，后来因为该病以皮肤损害为主，而且与药疹样皮炎相似，故称为“三氯乙烯药疹样皮炎”。皮肤损害是三氯乙烯药疹样皮炎病人的特征性改变，一般在接触TCE 2～5周后发病，脸部和四肢躯干等处皮肤出现红斑、皮疹、水疱，根据病情分为大疱性皮炎、剥脱性皮炎和大疱性表皮坏死性松解症[1－4]。该病的另一个特点是初次接触TCE时并不引起皮肤反应，经过一定潜伏期后再接触TCE时则很快在接触部位发生反应[2－3]。

　　豚鼠最大值试验(GPMT)是国内外评价化学品皮肤致敏作用的常用方法 [7－8],卫生部颁布的《化妆品卫生规范》2007年版就采用GPMT试验[6]。本实验采用GPMT试验，通过背部皮内注射TCE染毒使豚鼠致敏，观察到TCE实验组豚鼠背部出现皮肤红斑和水肿的皮肤损害，说明TCE致豚鼠皮肤变态反应动物模型建立成功。

　　本实验探讨TCE染毒豚鼠后脾和外周血淋巴细胞凋亡基因Bcl_2、BAX和BAD的表达水平是否发生改变。细胞凋亡是指为维持内环境稳定、由基因控制的细胞自主的程序性死亡，与机体发育、组织自稳定、自身免疫疾病和神经退行性疾病的发生密切相关。根据Bcl_2家族成员结构和功能的不同,可将Bcl_2家族分为抑制凋亡的家族成员(Bcl_2, Bcl_xl等)和促进凋亡的家族成员(BAX,BAD等)，这两类物质相互结合彼此抑制, 往往由其数量的相对多少决定凋亡发生与否。BAX与Bcl_2属于Bcl_2家族成员，两者可形成异源二聚体，BAX被称为死亡激动剂，当BAX超表达时，细胞凋亡增多，而当Bcl_2超表达时，它与BAX形成异源二聚体，细胞凋亡被抑制[9－11]。本文结果表明，TCE染毒豚鼠后脾淋巴细胞凋亡基因Bcl_2、BAX、BAD的mRNA表达明显升高，但TCE染毒对外周血淋巴细胞凋亡基因表达水平无明显改变。虽然国内外对TCE致皮肤变态反应进行了大量研究，但迄今为止没有获得充分阐明，不同作者发表的论文都是从某个方面进行探讨。本文成功建立TCE染毒致豚鼠皮肤变态反应动物模型，测定脾和外周血淋巴细胞凋亡基因表达水平，期望为揭示TCE致敏的发病机制提供科学依据。本文结果提示，TCE引起豚鼠皮肤出现严重变态反应，是否与某些淋巴细胞凋亡基因表达水平发生变化有关，值得进一步探讨。

参考文献

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收稿日期： 2010－04－14； 修订日期： 2010－07－09

基金项目： 深圳市科技计划项目(200802073)

作者简介： 刘月峰(1985－　)，男，硕士研究生，研究方向：细胞生物学。

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