刘 琨/张学红/任育宏/赵丽辉/石 馨/薛石龙/马晓玲/贾学玲
(兰州大学第一医院生殖医学研究中心,甘肃兰州 730000)
Clinical analysis of preimplantation genetic diagnosis with fluorescence in situ hybridization
LIU Kun, ZHANG Xue_hong, REN Yu_hong, ZHAO Li_hui, SHI Xin, XUE Shi_long, MA Xiao_ling, JIA Xue_ling
(Reproductive Medical Center of the First Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, China)
【摘要】 目的: 探讨应用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridisation,FISH)技术对染色体异常携带者进行种植前胚胎遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis, PGD)的临床意义。方法: 根据携带者染色体异常种类,分别选择相应的亚端粒探针和着丝粒探针或性染色体探针,进行1次或者2次杂交,对7例染色体异常携带者进行了胚胎种植前遗传学诊断。 结果: 7例染色体异常携带者进行了7个周期的PGD,获卵131枚,活检77枚胚胎,检出卵裂球87枚,移植20枚胚胎,4例临床妊娠,其中2例已分娩健康婴儿。结论: 应用荧光原位杂交技术对染色体异常携带者的胚胎进行种植前遗传学诊断是一种有效方法。
【关键词】 性染色体; 荧光原位杂交; 种植前遗传学诊断
中图分类号: R715.5 文献标识码: A 文章编号: 1004-616X(2010)05-0383-03
【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To evaluate clinical significance of application of fluorescence in situ hybridization in preimplantation genetic diagnosis (PGD) for carriers of chromosomal abnormalities. METHODS: according to the categories of chromosomal abnormalities, we selected the appropriate sub_telomeric probes and centromere probes, or sex chromosome probe, hybridized once or twice so the 7 carriers received preimplantation genetic diagnosis. RESULTS: Preimplantation genetic diagnosis were performed in 7 cycles of 7 couples. A total of 131 oocytes were retrived, 77 embryos were available for biopsy, 87 blastomeres detected, 20 embryos transplanted, 4 clinical pregnancies obtained, and 2 healthy babies had been. CONCLUSION: Application of fluorescence in situ hybridization technique in preimplantation embryo genetic diagnosis for carriers of chromosomal abnormalities was an effective way.
【KEY WORDS】 sex chromosome; fluroscence in situ hybridization; preimplantation genetic diagnosis
夫妇为染色体异常携带者所导致的胚胎染色体异常是引起女性不孕、反复流产及死胎的重要因素,选择染色体正常胚胎移植则可以避免此类情况的发生。荧光原位杂交技术(fluroscence in situ hybridization,FISH)是细胞遗传学和分子生物学相结合的一种新技术,由于其具有准确、可靠、快速等优点,因此被应用于性别鉴定、染色体非整倍体筛查和染色体结构异常的胚胎种植前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)。本研究应用FISH技术进行了7个周期的PGD,现将结果报道分析如下。
1 材料与方法
1.1 对象
2006年12月至2009年8月期间,兰州大学第一医院生殖医学研究中心接诊7例染色体异常携带者,其中5例为平衡易位携带者:病例1药流2次,继发不孕1年[46,XY,t(9;13)(q22;q12)];病例2反复流产4次[46,XY,t(1;2)(q44;q33)];病例3、4、5分别因少弱畸精子症[46,XY,t(1;18)(q32;q22)]、畸精子症[46,XX,t(11;12)(p13;p13)]、排卵障碍[46,XX,t(5;10)(p15;q22)]表现为原发不孕。病例6为罗伯逊易位携带者[46,XY,der(13;14)(q10;q10)],原发不孕12年,弱精子症。病例7为超雄综合征[47,XYY],原发不孕8年,无精子症。7例染色体异常携带者配偶染色体核型均正常。女方平均年龄30岁,男方平均年龄32岁。病例5因卵巢过度刺激(ovarian hyperstimulation syndrome,OHSS)取消移植,胚胎冷冻保存,3个月后解冻行PGD。
1.2 主要仪器和试剂
主要仪器:相差显微镜(Nikon TES 100,日本),显微操作系统(RI,英国),激光系统(OCTAX,德国),杂交仪(Thermo Brite StatSpin,美国),荧光显微镜(Nikon 80i,日本),FISH图像分析系统(Cytoscan,美国)。主要试剂:低渗液,0.2 mg/ml BSA/1%柠檬酸钠;固定液I,0.1% Tween_20/0.01N HCl;固定液II,甲醇∶冰乙酸(3∶1);洗脱液I,0.4×SSC/0.1% NP_40,pH 7.0;洗脱液II,2×SSC/0.3% NP_40,pH 7.0;荧光标记探针,均购自美国Vysis公司。
1.3 方法
1.3.1 卵裂球活检和固定 采用兰州大学第一医院生殖医学研究中心常规黄体期长方案(在前次月经周期的第21天,即黄体中期开始使用GnRHa,GnRHa使用的第10天,即本次月经的第3天开始使用促排卵药物,然后不定期进行B超监测卵泡的生长情况,并抽血测定雌激素含量,根据B超和雌激素结果判断卵巢对药物的反应并据此调整促排卵药物的使用剂量;直到直径大于1.6 cm的卵泡≥3个,于当天晚上注射5 000~10 000 IU HCG以促使卵子成熟;HCG注射36 h后取卵)对女方进行控制性超促排卵,取卵后4~6 h体外受精,7例携带者中6例行单精子卵胞浆内显微注射(intracytoplasmic sperm injections, ICSI)受精,1例行IVF/ICSI。受精后14~16 h观察受精情况,取卵后第3天根据胚胎发育情况,对4细胞以上胚胎进行活检,每枚胚胎活检1~2个卵裂球。将活检胚胎置于无Ca2+、Mg2+的HEPES液滴中,用激光(OCTAX_LaserShot)在透明带上打孔,直径约30 μm,用RI显微操作系统活检卵裂球,核查卵裂球的间期核,如果无核或多核,沿原孔进入活检吸取第2个卵裂球。活检后胚胎转入VitroLife GII培养液滴中继续培养。将取出的卵裂球用Tween_20/HCL+甲醇/冰醋酸法固定。
1.3.2 荧光原位杂交 细胞固定后置于2×SSC中平衡10 min,经70%、85%、100%梯度酒精一次脱水各2 min,室温晾干。根据患者易位染色体选择探针组合,具体配制参照Vysis说明书中,加于样本玻片标记好的杂交区内,覆盖干净盖玻片,边缘用封片胶封片后置于杂交仪中,启动已设置好的程序:73 ℃变性5 min,37 ℃杂交14~16 h。小心揭去封片胶,于73 ℃、 0.4×SSC/0.3%NP_40中洗脱2 min,室温2×SSC/0.1%NP_40中洗脱30 s,暗室晾干,加10 μl二脒苯基吲哚(DAPI)复染。Nikon 80i荧光显微镜下观察、摄像,CytoScan FISH工作站进行杂交结果图像分析。病例1、4一次杂交3种探针;病例6、7一次杂交2种探针;病例2、3、5杂交了2次,第一次杂交2种探针,第二次杂交1种探针。二次杂交后即将样本玻片置于甲醇中洗脱10 min,梯度酒精脱水,室温晾干,其他步骤同第一次杂交。
1.3.3 信号判断标准 细胞有丝分裂间期和中期,细胞核在常染色体每种颜色的荧光信号有2个 (即正常/平衡易位核型)。卵裂球细胞核1个红、绿色信号均提示为单倍体, 3个及3个以上红、绿信号均提示为多倍体;红色、绿色信号数目不等,提示为非平衡易位核型。性染色体在正常女性细胞核显示2个绿色荧光信号,正常男性为1个红色信号和1个绿色信号。本研究病例7选择荧光原位杂交分析XX或XY胚胎移植,其余6例选择正常或平衡易位核型且发育较好的胚胎进行移植。
2 结 果
见表1。7个PGD周期共获得卵子131枚,第2次减数分裂中期卵114枚,发育胚胎97枚,活检了77枚胚胎,检出卵裂球87枚,胚胎活检成功率98.86%(86/87),单细胞固定率98.84%(85/86),FISH杂交成功率91.76%(78/85)。
7个PGD周期,4个周期妊娠,临床妊娠率(57.14%)。包括病例2孕34周顺利分娩1男婴和1女婴,病例3孕足月剖宫产1男婴,分娩时采脐血培养,核型分析染色体均正常。病例5妊娠7周B超提示单胎。病例6妊娠7周B超检查提示3胎,行减胎术。
3 讨 论
由于目前无法对配子和种植前胚胎进行显带,因此还无法检测其易位分离的方式,以及从总体上了解胚胎的全部染色体是否正常。利用FISH对易位携带者的胚胎进行种植前诊断的原理[1]就是依据FISH信号的数目及其几何学近似性,利用不同的荧光染料,每一种代表一段染色体特异性的DNA序列,就可在间期细胞中判断易位染色体的存在与否,并通过记录信号的总数及其向光近似性来推测染色体的不平衡状态。据此,选用不同颜色标记的相应易位染色体的亚端粒探针和着丝粒探针或者用跨断裂位点探针对单个卵裂球的间期细胞核进行FISH检测,可区分正常/平衡易位和不平衡易位胚胎。理论上,常染色体罗氏易位形成6种配子,平衡易位可形成18种配子,均只有1种正常配子和1种平衡配子。但有研究显示各种类型配子的比例与理论值存在差异[2],其中正常胚胎比例为11.11%~50.00%,本研究中6例染色体相互易位(其中包括一例罗氏易位)携带者,平均正常胚胎比例为29.69%。。
应用FISH 技术进行PGD具有准确、可靠、快速等优点,但是对FISH 操作的全过程中的每个细节均要严格掌握,否则影响FISH 信号结果,减少可移植胚胎或者误移入异常胚胎。譬如,活检时应寻找有明确的单个间期细胞核的卵裂球,无核或者多核都将导致无法获得来源胚胎的准确信息;单卵裂球固定是进行PGD的前提,也是关键所在,固定技术不熟练、残留胞质过多、细胞核皱缩或者折叠都可能导致细胞核丢失,信号重叠或者杂质干扰而影响信号的判断;另外,样本玻片在变性前晾干;样本玻片漂洗时的力度,探针的选择等都可能会影响最终结果。其次,影响FISH准确性的很大因素是染色体嵌合,因此常需同时活检两个卵裂球增加PGD的可信度,但目前也有研究显示嵌合型可能是胚胎发育过程中的正常现象[3];本研究中病例7为解冻胚胎行PGD,仅1枚胚胎信号显示为正常/平衡易位胚胎,经讨论后除这枚胚胎,还移植了两枚认为可疑的胚胎,妊娠7周B超显示单胎妊娠,因此胚胎冷冻、复苏是否会造成染色体损伤,导致FISH信号错误还有待于进一步研究。
(致谢:温州医学院黄学峰教授在实验过程中给予我们技术指导与帮助,在此表示衷心感谢)
参考文献
[1] Scriven PN,Flinter FA,Braude PR,et al. Robertsonian translocations reproductive risks and indications for preimplantation genetic diagnosis[J]. Hum Reprod,2001,16(11):2267-2273.
[2] Pujol A,Durban M, Benet J,et al. Multiple aneuploidies in the oocytes of balanced translocation carriers: a preimplantation genetic diagnosis study using first polar body[J]. Reproduction, 2003,126(5):701-711.
[3] Wendy P, Julie L,Micheil A, et al. Origin and outcome of pregnancies affected by androgentic/biparental chimerism[J]. Hum Repod,2007,22(4):1114-1122.
收稿日期: 2009-12-14; 修订日期: 2010-04-22
基金项目: 甘肃省医药学产学对接项目(01CX_02)
作者简介: 刘 琨(1978- ),女,主治医师,硕士研究生,研究方向:生殖与遗传。
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