李启凤/吴名耀

(汕头大学医学院病理学教研室， 广东 汕头 515041)

The expression of EGFR, VEGFR1/Flt_1 in esophageal squamous cell carcinoma tissues with or without radiotherapy

LI Qi_feng, WU Ming_yao

(Department of Pathology, Shantou University Medical College, Shantou 515041, Guangdong, China)

　　【摘要】 目的： 探讨食管鳞癌组织中内皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子受体1(VEGFR1/Flt_1 )的表达与术前辅助放疗敏感性的关系。 方法： 采用免疫组织化学染色方法(EnVision二步法)检测40例未接受放疗和40例接受放疗后手术切除的食管鳞癌组织，以及20例切除组织的上切缘正常组织中EGFR、VEGFR1/Flt_1的表达。 结果： EGFR在正常组织中无表达，在未接受放疗食管鳞癌中的表达率为77.5％，在接受放疗后食管鳞癌中的表达率为70％，EGFR在放疗后食管鳞癌中的表达与未放疗食鳞癌的表达相比，经卡方检验其差异具有统计学意义(P<0.05)。VEGFR1/Flt_1在正常组织中阳性表达率为80％，在未接受放疗食管鳞癌中的表达率为62.5％，在接受放疗后食管鳞癌中的表达率为80％，VEGFR1/Flt_1在放疗后食管鳞癌中的表达与未放疗食管鳞癌的表达相比较，经卡方检验其差异具有统计学意义 (P<0.05)。 结论： 检测EGFR、VEGFR1/Flt_1有助于预测食管鳞癌术前放疗的疗效。

　　【关键词】 食管鳞癌； 放射治疗； 内皮生长因子受体； 血管内皮生长因子受体1

　　中图分类号： R363.1　　　　文章标识码： A　　　　文章编号： 1004－616X(2010)－05－0386－05

　　【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To investigate the expressions of EGFR(endothelial growth factor receptor), and VEGFR1/ Flt_1(vascular endothelial growth factor receptor 1/Flt_1) in esophageal squamous cell carcinoma tissues with or without radiotherapy, and evaluate the correlation between the expressions and the sensitivity of preoperative radiotherapy. METHODS: We used immunohistochemical method(EnVision) to assess the expressions of EGFR and VEGFR1/Flt_1 in 40 squamous cell carcinomas with radiotherapy, 40 without radiotherapy, and 20 normal tissues at the proximal end of resection. RESULTS: For EGFR, there was no expression in normal esophageal tissues, but 70％ and 77.5％expression in esophageal squamous cell carcinoma with and without radiotherapy, respectively (P<0.05). For VEGFR1/Flt_1, 80％ expression in normal tissue was observed, while 80％ and 62.5％ in esophageal squamous cell carcinoma with and without radiotherapy, respectively, were found (P<0.05). CONCLUSION: EGFR, VEGFR1/Flt_1 could be used as marker for esophageal squamous cell carcinoma radiotherapy sensitivity preoperatively.

　　【KEY WORDS】 esophageal carcinoma; radiotherapy; endothelial groth factor receptor; VEGFR1/Flt_1

　　食管癌是潮汕地区常见的恶性肿瘤。目前外科手术是食管癌最有效的治疗手段。但是绝大部分患者就诊时已处于中晚期，已失去手术的机会。放射治疗能使癌细胞退化、失去活性、瘤体缩小、脉管栓塞以及消灭微小转移灶。且食管鳞癌的术前放疗可以提高手术切除率，降低局部复发率和减少淋巴结转移率。

　　内皮生长因子受体(endothelial growth factor receptor,EGFR)是一种具有酪氨酸激酶活性的膜表面传感器，在人类的多种恶性肿瘤中高表达，与肿瘤的发生发展密切相关。EGFR是头颈部的鳞状细胞癌细胞增殖的一个关键控制器，由此引发了学者对EGFR与放射治疗关系的研究。

　　血管内皮生长因子受体1(vascular endothelial growth factor receptor 1/Flt_1, VEGFR1/Flt_1)是一种细胞膜受体激酶，主要位于血管内皮细胞上，是与VEGF具有高度亲和力的受体， VEGFR1参与内皮细胞的生长和血管生成，是血管内皮生长因子(VEGF)促进癌细胞生长发展的传导通路中的一个重要媒介体[1]。近年研究发现，一些肿瘤细胞不但通过分泌VEGF刺激内皮细胞增殖促进血管生成，而且自身也能表达VEGFR1/Flt_1。目前VEGFR1在食管鳞癌及放疗后鳞癌中的表达的情况尚不明确。

　　本研究对EGFR和VEGFR1在未放疗和放疗后食管鳞癌中的表达进行检测，探讨食管鳞癌组织中EGFR、VEGFR1/Flt_1表达与食管鳞癌术前辅助放疗敏感性的关系、及其与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移的关系，探讨EGFR、VEGFR1/Flt_1作为放疗反应蛋白受体的可能性。

1　材料与方法

1.1　标本

　　收集汕头大学医学院病理科1996～2009年间的食管癌手术切除标本100例，其中术前未接受放、化疗标本和术前接受放疗后的标本(选择放疗反应轻_中度，放疗剂量在40～50 GY)各40例，同时收集20例手术切除未接受放、化疗食管鳞癌标本的上切缘正常组织。40例未接受放、化疗的食管鳞癌标本中男性32例，女性8例，年龄34岁～76岁，平均54.83岁；病理组织学诊断按WHO(2000年)肿瘤组织学分类标准： I级13例，II级17例，III级10例；浸润深度：肌层6例，外膜34例；有淋巴结转移14例，无淋巴结转移26例。接受放疗后食管癌标本中男性38例，女性2例，年龄32～69岁，平均52.65岁；病理组织学诊断按WHO(2000年)肿瘤组织学分类标准： I级10例，II级27例，III级3例；浸润深度：肌层14例，外膜26例；有淋巴结转移14例，无淋巴结转移26例。放疗反应程度：轻度放疗反应14例，中度放疗反应26例。

1.2　材料

　　EGFR鼠抗人单克隆抗体、VEGFR1/Flt_1兔抗人多克隆抗体、二抗[Supervision Universal(Anti_Mouse/Rabbit) Detection Reagent，HRP]和DAB显色试剂盒均为美国抗体诊断公司产品，购于上海长岛生物科技有限公司。

1.3　免疫组化检测

　　所有标本均经10％中性福尔马林液固定，石蜡包埋，4 μm连续切片，二甲苯脱蜡，逐级酒精至水，分别进行HE染色和免疫组化染色。具体步骤严格按说明书进行，每次染色均设已知阳性组织切片作为阳性对照，以PBS和正常小鼠/兔血清代替一抗作阴性对照。

1.4　结果判定

　　EGFR、VEGFR1/Flt_1蛋白阳性染色为棕黄色颗粒状，EGFR表达于细胞浆和细胞膜，VEFGR1/Flt_1表达于细胞浆。对每张切片随机选取5个高倍视野，以阳性细胞所占比例的平均值定义为阳性细胞率(％)。判断标准：阳性细胞率≤10％为(－)；>10％～25％为(＋)；>25％～75％为(＋＋)；>75％为(＋＋＋)。由3名病理医生进行观察判断，对独立判断不一致其病例的阳性数取平均值。

1.5　食管癌组织放疗后形态学改变的判断标准[2]

　　轻度放疗反应：瘤细胞大部分存在，仍较活跃，有散在不同程度退化性变的癌细胞，细胞肿胀，胞浆空泡性变，核肿胀或浓缩。在退化性的瘤细胞周围，有散在的细胞碎片及少量炎细胞浸润。瘤组织往往角化较明显。中度放疗反应：瘤细胞大部消失，少数残存退化性变的瘤细胞为肉芽组织或纤维组织所包饶，瘤床内可见大片角化物质或不全角化物质，有时可见胆固醇结晶、钙化结节、泡沫细胞浸润以及异物巨细胞反应。

1.6　统计学方法

　　应用SPSS 13.0软件包进行统计学分析，采用卡方检验和校正的卡方检验，以及spearman等级相关分析法检验，以α=0.05为检验水准。

2　结　果

2.1　EGFR和VEGFR1/Flt_1蛋白表达情况

　　EGFR和VEGFR1/Flt_1蛋白在正常食管鳞状上皮、未放疗和放疗后食管鳞癌组织中的表达情况见表1。在正常食管黏膜中， EGFR无表达， VEGFR1/Flt_1的阳性表达率为80％；未接受放疗的食管癌组织标本的EGFR表达率77.50％(图1)；在接受放疗后食管癌组织标本中EGFR的表达(图2)有所下降(70％)。VEGFR1/Flt_1在未接受放疗的食管鳞癌组织中的表达率为62.5％(图3)；在接受放疗后食管癌标本中的表达率为80％(图4)，EGFR在未放疗食管鳞癌中的表达与正常食管癌黏膜的表达相比，其差异具有统计学意义(P<0.01)；EGFR在放疗后食管鳞中的表达与未放疗食管鳞癌的表达相比，其差异具有统计学意义(P<0.05)。VEGFR1/Flt_1在未放疗食管鳞癌中的表达与正常食管黏膜中的表达相比，其差异无统计学意义(P>0.05)；VEGFR1/Flt_1在放疗食管鳞癌中的表达与未放疗食管鳞癌中的表达相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.2　EGFR、VEGFR1/Flt_1蛋白的表达与组织学分级、浸润程度及淋巴结转移、放疗反应程度的关系

　　结果见表2、3。EGFR和VEGFR1/Flt_1的表达，在组织学分级、浸润程度、以及有无淋巴结转移方面，未放疗食管鳞癌组织与放疗后食管鳞癌组织间比较，差别无统计学意义(P>0.05)。在接受不同放疗程度的食管鳞癌组织间，EGFR和VEGFR1/Flt_1蛋白表达的差异无统计学意义(P>0.05)(表3)。

2.3　EGFR与VEGFR1/Flt_1蛋白表达的相关性分析

　　EGFR及VEGFR1/Flt_1蛋白的表达在未接受放疗食管鳞癌组织有相关性，差别无统计学意义(r=0.4，P>0.05)；EGFR与VEGFR1/Flt_1蛋白的表达在放疗后食管鳞癌组织呈负相关，差别无统计学意义(r= －0.899， P>0.05)。

3　讨　论

　　放射物理学和放疗生物学的发展很大程度上促进了肿瘤治疗的发展，但并未能真正控制原发肿瘤的扩散或转移,导致肿瘤治疗结果的不满意[3]。EGFR、VEGFR1/Flt_1与肿瘤细胞的增殖和血管的形成密切相关,其在肿瘤中的表达情况可以反映患者的预后和对放疗的疗效[4－5]。

　　EGFR是一个很有前景的靶向治疗目标，一方面因为它在大部分实体癌中高表达，另一方面这个受体以及ErbB家族成员参与许多“标志性”癌[6]的表达。有研究报道EGFR的高表达可促进血管生成和肿瘤细胞的增殖、粘附、侵袭和转移，抑制肿瘤细胞的凋亡[7]。关于EGFR与放疗治疗的研究集中于其调节细胞增殖的能力，自90年代中期开始,单抗类EGFR抑制剂就开始与放疗结合进行临床研究，大量研究已证实EGFR抑制剂是头颈部肿瘤比较理想的放疗增敏药物，抗EGFR可使肿瘤细胞阻滞于G1期，而放疗使细胞阻滞于G2期，因此EGFR抑制剂与肿瘤放疗联合作用于细胞增殖周期G1、 G2检测点可加强对肿瘤的治疗作用。研究表明[8] EGFR抑制剂结合放疗应用于宫颈鳞癌的术前、术后放疗具有较好效果，提示EGFR是一种有前景的治疗目标。Michael R[9]等通过对78例口腔鳞癌进行免疫组化和FISH发现EGFR基因拷贝数和EGFR蛋白表达显著相关，放疗可使肿瘤细胞EGFR表达减少而同时其基因拷贝数也相应减少。之前已有研究认为高表达EGFR的肿瘤可抵抗放射线诱导肿瘤细胞的凋亡，暴露在EGFR中的肿瘤细胞受辐射的损伤小，意味着EGFR可调节肿瘤细胞免疫反应对抗放射毒性[10]。本研究表明，相对于正常组织来说，EGFR在非放疗食管鳞癌组织的高表达，表明EGFR能促进肿瘤细胞增殖；而EGFR在非放疗食管鳞癌组织和放疗后鳞癌组织中表达的差异性提示EGFR可作为食管鳞癌放疗的敏感指标之一。未接受放疗食管癌组织EGFR的表达与组织学分级、浸润程度、放疗程度分级的差异性无统计学意义，提示EGFR的高表达能保护肿瘤细胞免受凋亡，并与肿瘤细胞的修复和存活密切相关，导致肿瘤细胞对放射线不敏感,这与之前的研究相符合[11]，由此推测EGFR抑制剂应用于临床肿瘤的放疗具有一定的作用。

　　恶性肿瘤生长较快，必须有大量的营养物质供应。肿瘤生长初期为无血管生长期，只有依靠弥散作用来获取营养，当肿瘤长到2～3 mm时，必须有新生血管的产生来提供不断生长所需要的血液[12]。抑制血管新生来治疗实体瘤激励着人们探索食管癌的抗血管新生疗法。VEGFR1/Flt_1是血管内皮生长因子受体家族中的成员之一，主要在血管内皮细胞表达，VEGFR1/Flt_1激活后具有调节内皮细胞之间以及内皮细胞与基底膜之间的相互作用，能促进血管腔的形成。本研究表明食管鳞癌中VEGFR1/Flt_1的表达较正常食管上皮组织下降，是因为VEGF与其细胞表面的VEGFR1/Flt_1相结合，通过自分泌途径促进肿瘤细胞增殖；而在放疗后食管癌组织中VEGFR1/Flt_1的表达增多，可能是放射线抑制了VEGF与肿瘤细胞表面VEGFR1/Flt_1的结合，从而阻断VEGF刺激肿瘤细胞增殖的细胞传导途径，达到治疗食管鳞癌的作用。针对VEGFR1/Flt_1的表达与各种肿瘤临床病理研究：神经母细胞瘤中VEGFR1/Flt_1表达与临床分期无关[13]；鼻咽癌的侵犯范围(T分期)与VEGFR1/Flt_1无关 [14]；我们的研究结果发现VEGFR1/Flt_1与未放疗食管鳞癌和放疗后食管鳞癌组织学分级、浸润程度和淋巴结转移没有明显关系；同时，VEGFR1/Flt_1在放疗后食管鳞癌中的表达与其放疗程度也无明显关系；这可能是由于样本量太小的缘故。另有研究报道[15] VEGFR1/Flt_1的缺乏可增加血管内皮细胞的有丝分裂，VEGFR1/Flt_1显然参与VEGF调节血管生成。因此，抗VEGFR1/Flt_1结合放疗应用于食管鳞癌的治疗，可抑制肿瘤组织血管的生成而使瘤体缩小，血管闭塞减少其扩散、转移的机会，从而达到治疗目标。

　　非放疗食管癌和放疗后食管癌中EGFR与VEGFR1/Flt_1表达的相关性目前尚未见报道，本研究结果显示放疗后食管癌中无淋巴结转移的食管癌中EGFR、VEGFR1/Flt_1的阳性表达率明显高于有淋巴结转移的食管癌，但差别没有统计意义；本研究表明，相对于有淋巴结转移的食管鳞癌，无淋巴结转移的食管癌组织放疗效果优于前者。

　　EGFR、VEGFR1/Flt_1与食管的癌变有关，且EGFR、VEGFR1/Flt_1可作为独立的指标来预测食管鳞癌患者对放疗的敏感性，采用EGFR、VEGFR1/Flt_1抑制剂联合术前放疗、手术切除，可能会提高食管鳞癌的治愈率。

参考文献

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收稿日期： 2010－01－14； 修订日期： 2010－03－10

作者简介： 李启凤(1985－　)，女，贵州遵义人，硕士研究生，研究方向： 食管癌

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