张晓红/张虎芳/王　青

(太原师范学院生物系， 山西 太原 030031)

Effect of paraquat on the expressions of peroxidase and esterase in goldfish serum

ZHANG Xiao_hong,  ZHANG Hu_fang, WANG  Qing

(Department of Biology, Taiyuan Teachers College, Taiyuan 030031,Shanxi, China)

　　【摘要】 目的： 探讨除草剂百草枯(paraquat)对金鱼(Carassius auratus)血清过氧化物酶(peroxidase，POD)和酯酶(esterase，EST)表达的影响。 方法： 依据百草枯的24 h半数致死剂量设置0.5、1.0、1.5、2.0 ml/L共4个浓度组，每个浓度组按0.1 ml/g剂量金鱼腹腔注射给药，染毒后断尾取血，采用聚丙烯酰胺方法检测金鱼血清POD和EST的表达，对照组金鱼腹腔注射等量生理盐水。 结果： 与对照组相比，百草枯4个浓度组对金鱼血清POD和EST的活性均有显著影响，在低于半数致死浓度(0.5、1.0 ml/L)时POD酶活性增强，EST酶活性被抑制，表现为应急性；高于半数致死浓度(1.5、2.0 ml/L)时POD酶活性先减弱后增强，EST酶活性先增强后减弱，酶活性与染毒浓度存在剂量_效应关系。 结论： 百草枯对金鱼POD和EST均有影响，且对EST的毒性大于POD。

　　【关键词】 百草枯； 金鱼； 血清； 血清过氧化物酶； 酯酶

　　中图分类号： X5　　　　文献标识码： A　　　　文章编号： 1004－616X(2010)05－0391－03

　　【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To explore the effect of herbicide paraquat on the expression of peroxidase(POD) and esterase(EST) in Carassius auratus serum. METHODS: The 0.5,1.0,1.5 and 2.0 ml/L concentrations of paraquat were prepared according its 24 h LC50， Carassius auratus were treated with 0.1 ml/g dose of each concentration. SDS_polyarylamide gel were used to test the expressions of POD and EST. RESULTS: Compared with the control group, the four treated groups showed significant variety. The activities of POD and EST increased or decreased at low concentration，absent or increased at high paraquat concentration,concentration and activity had dose_effect relationship. CONCLUSION: The toxicity of paraquat on POD and EST varied in Carassius auratus.

　　【KEY WORDS】 paraquat； Carassius auratus； serum； peroxidase； esterase

　　百草枯(paraquat，PQ)是1962年由英国研发的一种作用迅速的除草剂和植物脱水剂，又名对草快、克无踪，为联吡啶类化合物，极易溶于水，属于速效接触型灭生性除草剂。目前在世界130多个国家和地区得到推广应用，由于具有良好的除草效果，百草枯广泛用于园林除草，作物及蔬菜行间除草，免耕地除草，草原更新，以及非耕地化学除草。

　　近年来，百草枯大量应用于农业及环境绿化。随着其日益推广使用，百草枯中毒事件呈逐年上升趋势，中毒的病死率较高，治疗也异常的困难。按我国农药毒性分级标准，百草枯为中等毒性除草剂，有关百草枯的毒性已有部分研究 [1－4]。由于农田施用的大部分除草剂最终都进入自然水体,无疑会对水生环境造成影响，而目前有关百草枯对水生生物的毒性研究报道较少，关于百草枯对鱼类血清过氧化物酶(peroxidase，POD)和酯酶(esterase，EST)的研究尚未见报道。我们以金鱼为实验材料，研究百草枯对其血清POD、EST酶的影响，探讨用金鱼血清POD、EST酶作为一项生化指标，监测百草枯对鱼类生物大分子的毒性，为百草枯的使用以及渔业的养殖提供基础依据。

1　材料与方法

1.1　材料

　　采用人工饲养的金鱼(Carassius auratus) ，体质量(4.5±0.5) g，体长(5.5±0.5) cm，购自太原市花鸟鱼虫市场；百草枯(20％水剂)购自太原市农业科技发展公司。北京六一DYY_ZC型稳压稳流电泳仪、DYCZ_24D型垂直板电泳槽。

1.2　方法

1.2.1　半数致死浓度(LC50)的确定　实验前将金鱼暂养在实验室经溶氧的，符合饮用水标准的自来水中。实验时挑选健康，活泼的个体进行染毒处理。稀释百草枯原液，配置各试验浓度，各浓度组均以0.1 ml/g的剂量进行腹腔注射染毒，采用平均数法[7]确定百草枯对金鱼染毒24 h半数致死浓度。

1.2.2　染毒　以所测的百草枯半致死浓度(1.24 ml/L)的1/3值作为最低参考浓度，等差设定4个百草枯(20％水剂)浓度组(0.5、1.0、1.5、2.0 ml/L)以及对照组(0.9％生理盐水)。每组随机选取金鱼5尾，按0.1 ml/g的剂量进行腹腔注射染毒，染毒24 h，试验期间不投饵。实验重复5次。

　　染毒24 h后，立即将金鱼取出放在纱布上擦干，断尾取血。将同一浓度组5条金鱼血放于装有8 U/ml的肝素钠的1 ml离心管内，摇匀，4 ℃下 1 500 r/ min冷冻离心10 min, 取上清液，按2∶1的比例加入40％的甘油和0.1％的溴酚蓝指示剂，用于电泳分析。

1.2.3 　POD、EST酶表达的检测　采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)法，分离胶浓度为8％，浓缩胶浓度为5％，电极缓冲液为Tris_甘氨酸，pH=8.8。用25 μl微量进样器点样，每孔点样量为15 μl，点样后将电泳槽移至4 ℃冰箱中进行电泳。电泳时，指示剂在浓缩胶内时用80～90 V电压，当指示剂完全进入分离胶后，将电压升高到120 V，总电泳时间约3 h。待指示剂(溴酚蓝)到达指定位置，停止电泳。

1.2.4　酶谱分析　POD酶用联苯胺染色，EST酶参照Shaw和Prasad[8－9]的方法染色。酶谱区带数目、染色强度用数码相机拍照，Bandscan凝胶图像分析软件计算其灰度值，并进行综合比较。

1.2.5　统计学方法　各组检测数据采用与对照组比值的相对表达值，以SPSS统计软件处理数据，采用one_way ANOVA分析。以α=0.05为检验水准。

2　结　果

2.1　百草枯对金鱼血清POD表达的影响

　　不同浓度百草枯急性染毒后，各浓度组金鱼血清POD只有1条酶带活性显著(图1)。对照组(0 ml/L)未见条带，POD几乎没有活性；百草枯浓度在0.5 ml/L、1.0 ml/L时， POD酶活性均显著增强，分别为对照组的8.08倍和7.92倍，浓度在1.5 ml/L时，POD酶活性下降，为对照组的6.69倍；在较高浓度(2.0 ml/L)时POD酶活性又增强，为对照组的7.84倍。POD酶活性呈现随百草枯浓度的升高而增强，但达到一定浓度后即出现下降，而后又随浓度的增加而增强。各浓度组POD酶活性与对照组间的差异均具有统计学意义(P<0.01)。

2.2　百草枯对金鱼血清EST表达的影响

　　不同浓度百草枯急性染毒后，金鱼血清各浓度组EST仅1条酶带表达(图2)。对照组(0 ml/L)酶带着色很深，酶活性较强。在百草枯浓度为0.5 ml/L时，酶带着色较浅,表明酶活性下降，是对照组的0.94倍(P<0.01)；而浓度为1.0、1.5 ml/L时，酶带着色变深，表明酶活性增强，为对照组的1.01倍(P<0.05)；在较高浓度时(2.0 ml/L)，酶带着色变浅，表明酶活性下降，为对照组的0.98倍，但与对照组间的差异无统计学意义。可见随百草枯浓度的升高EST酶活性表现为先下降后增强然后再下降的趋势。

3　讨　论

　　POD酶是一种诱导性酶，在生物体中起重要的保护作用，它能利用H2O2氧化供氢体，它对H2O2要求专一而对供氢体要求广泛，能够反映生物体产生和消除自由基的能力以及细胞代谢的强度[10]。

　　EST是广泛存在于生物体内的一类酯水解酶，对于酯代谢和生物膜的结构与功能具有一定作用，EST酶能水解大量的非生理存在的酯类化合物，包括某些药物，因此认为具有解毒作用。在环境毒物存在的情况下，EST酶会有显著应急的变化[11]。

　　研究表明，正常情况下金鱼血清POD表现为不表达或微量表达，EST表现为正常表达。在低于半数致死浓度(1.24 ml/L)的低浓度组0.5、1.0 ml/L染毒时，金鱼血清POD酶活性增强，呈超显性表达，表现为应急反应，在高于半数致死浓度1.5、2.0 ml/L时活性先下降后又增强； EST在低于半数致死浓度(1.24 ml/L)的低浓度组0.5、1.0 ml/L时活性先下降后增强，高于半数致死浓度1.5、2.0 ml/L时活性增强后下降。说明POD酶在高浓度时结构被破坏，而EST酶在低浓度时结构就已被破坏，即百草枯对金鱼血清EST酶的毒性大于POD酶。

　　百草枯主要通过对绿色植物的叶绿体破坏而达到除草作用。百草枯破坏叶绿体层膜，使其光合作用和叶绿素合成很快中止；能准确进入被称作光合系统I的生化系统，这一过程将产生推动光合作用的自由电子，百草枯离子与这些电子发生反应形成自由基，氧气迅速将这些自由基转化为过氧化物，这些过氧化物很容易和细胞膜内的不饱和脂肪酸发生反应。这一化学反应将导致细胞膜破坏，使大量的细胞内容物泄漏。百草枯对动植物有着共同的靶标，可见金鱼体内POD急性显性表达与百草枯引起体内过氧化物的大量产生有直接的关联，POD起着一定的应急保护作用。

　　随百草枯浓度的升高金鱼血清POD、EST酶活性都出现先下降后增强的变化，下降后增强的原因可能是百草枯达到一定浓度时使金鱼机体内部组织丧失了有效的调节能力，发生病变导致血细胞膜通透性增加，细胞内部的POD、EST酶开始大量释放进血液[9] 使血液中POD、EST酶浓度增加所致。

　　百草枯在一定的浓度下改变金鱼血细胞膜的通透性或破坏细胞膜，而使血细胞中POD和EST酶在不同的浓度下释放到血液中，这可能与百草枯不同浓度对金鱼血细胞的破坏程度不同，以及POD和EST本身的分子量大小不同通过细胞膜的机制不同有关，其机制有待于进一步研究。

　　本研究结果与沈明浩、权伍荣、刘菲[1－4]的研究结论相同，即百草枯对金鱼血清POD、EST酶有一定的毒性，且在低于半数致死浓度时存在一定的剂量_效应关系。

　　由于百草枯对单子叶和双子叶植物的绿色组织均有很强的破坏作用，但无传导作用，只能使着药部位受害。一经与土壤接触，即被吸附钝化，不能破坏植物根部和土壤内潜藏的种子，因而施药后杂草有再生现象，建议在晴天时低浓度使用百草枯。

参考文献

[1] 权伍荣,郭环宇,任大勇. 除草剂百草枯对大鼠及胎儿的毒性研究[J].食品科学, 2007,28(10)：510－513.

[2] 沈明浩,任大勇,李　嘉. 除草剂百草枯引起胎鼠动脉管收缩的作用机制[J].毒理学杂志, 2006,20(4)：236－238.

[3] 沈明浩,李大军,庄英男. 百草枯引起胎鼠动脉管收缩与内皮素及其受体的关系研究[J].中国畜牧杂志, 2006,42(11)：19－22.

[4] 刘　菲.斑马鱼胚胎发育技术诊断百草枯的生物毒性研究[D].河北医科大学, 2009:8.

[5] 李明云，黄福勇， 竺俊全.大弹涂鱼急性镉中毒对脾脏4种同工酶表达的影响[J].海洋水产研究，2005，26(2)：36－40.

[6] 黄福勇.急性镉中毒对大弹涂鱼血细胞同工酶表达的影响[J].水产学报，2004，26(2)：36－40.

[7] 孟紫强. 环境毒理学[M].北京：中国环境科学出版社, 2000：44－50，496－512.

[8] Shaw CR， Prasad R. Starch gel electrophoresis of enzymes_a complation of recipes[J]. Biochem Genet, 1970，4(2)：297－

320.

[9] 王中仁.植物等位酶分析[M]. 北京：科学技术出版社，1996：140－163.

[10] 罗　曼，蒋立科. 野生与养殖长吻鳜血液及不同器官同工酶的比较[J]. 应用与环境生物学报，2000,19(5)：447－451.

[11] 贾秀英，董爱华. 铅对蟾蜍肝、肾过氧化物酶和酯酶同工酶的影响[J]. 生态学杂志，2005，24(2):159－162.

收稿日期： 2010－04－06； 修订日期： 2010－06－07

基金项目： 山西省高校科技开发项目(200611040)

作者简介： 张晓红(1963－　),女,山西平陆人,博士研究生,副教授，研究方向：动物学及环境毒理学。

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