解丽君1/赵　松2/郝　娜1/李立萍1/李国风1

(1. 河北省疾病预防控制中心药物研究所， 河北 石家庄 050021； 2. 河北医科大学病理教研室，河北 石家庄 050017)

Effect of chronic alcohol intake on apoptosis and proliferation in spermatogenic cells in rats

XIE Li_jun1, ZHAO Song2, HAO Na1, LI Li_ping1, LI Guo_feng1

(1. Hebei Provincial Centre for Disease Prevention and Control, Shijiazhuang 050021; 2. Department of Pathology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017,Hebei, China)

　　【摘要】 目的： 观察长期摄入酒精对大鼠生精细胞增殖和凋亡的影响，以探讨酒精致生精功能障碍的机制。 方法： 40只健康雄性成年SD大鼠随机分为3个不同酒精剂量的实验组(2.7、4.5、7.5 g/kg)和1个对照组(蒸馏水)，共4组。各组每日分别灌胃给予受试物，连续13周，末次给予受试物24 h后处死大鼠。在光镜下观察睾丸组织形态学, 采用原位末端标记(TUNEL)法检测睾丸生精细胞凋亡，用流式细胞术(FCM)检测生精细胞凋亡率和计数各级生精细胞。用Western blot检测睾丸中Caspase_3以及核增殖抗原PCNA的表达。 结果： 光镜观察显示酒精组，尤其是7.5 g/kg剂量组动物睾丸出现生精细胞核固缩、变性等细胞凋亡形态学改变，曲细精管腔中脱落细胞增多，且随酒精剂量的增加生精细胞的损伤加重。酒精4.5、7.5 g/kg剂量组生精细胞凋亡率明显升高，FCM检测单倍体和四倍体细胞群计数下降(P<0.05或P<0.01)，PCNA表达降低(P<0.05), Caspase_3表达明显增强(P<0.05或P<0.01)。 结论： 长期摄入酒精可以诱导生精细胞凋亡增加和PCNA表达减弱，这可能是酒精致生精功能障碍的机制之一。

　　【关键词】 酒精； 生精细胞； 大鼠； 凋亡； 核增殖抗原； 睾丸

　　中图分类号： R994　　　　文献标识码： A　　　　文章编号： 1004－616X(2010)05－0394－03

　　【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To explore the mechanism of spermatogenesis inhibition induced by chronic alcohol consumption, and to examine the apotosis and proliferation of spermatogenic cells. METHODS: 40 healthy Sprague_Dawley adult male rats were randomly divided into four groups. Different doses of alcohol(0,2.7,4.5 and 7.5 g/kg) were administrated to the rats for 13 weeks by a gastric tube. The histological changes of rat testicular tissue were examined by light microscopy. The apoptosis and count of germ cells were evaluated by Flow Cytometry(FCM) and TUNEL, respectively.The expression of Caspase_3 and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in testes were detected by western blot. RESULTS: Light microscopic evaluation of testes demonstrated typical morphological changes of germ cell apoptosis including nuclear degeneration, condensation, and increased sloughed cellular element in tubular lumina especially in 7.5 g/kg alcohol_treated rats. Furthermore, the degree of testicular injury was associated with the dose of alcohol. Compared with control group , the apoptosis index in alcohol 7.5 g/kg group was higher(P<0.05). There was a marked decrease in haploid and tetraploid cells and significantly down_regulated expression of PCNA in alcohol 7.5 g/kg group(P<0.05). Western blot analysis showed that the expression of Caspase_3 increased markedly and the expression of PCNA significantly decreased in alcohol_treated group(P<0.05). CONCLUSION: Chronic alcohol intake could lead to an enhancement of germ cell apoptosis and a reduction of cell proliferation in rat testes, which may at least partly contribute to spermatogenesis inhibition.

　　【KEY WORDS】 alcohol; germ cell; rat; apoptosis; proliferating cell nuclear antigen; testes

　　酒精是当今世界上应用最广泛的滥用物质之一。据研究表明，男性酗酒可使血清睾酮下降，性功能减退并引起后代发育和行为异常[1－2]。睾丸内精子发生是一个复杂的过程，其中存在多种调节机制，正常情况下，生精细胞的凋亡与增殖维持着动态平衡，从而调节精子发生和异常生精细胞的清除[3]。酒精所致睾丸损伤的机制是否与生精细胞凋亡和增殖失衡有关，以及哪些凋亡调控基因参与，尚少见报道。本研究初步探讨长期摄入酒精对大鼠生精细胞增殖和凋亡的影响，并初步探讨酒精致睾丸损伤的机制。

1　材料与方法

1.1　实验动物及分组

　　选体质量180～220 g健康性成熟雄性SD大鼠40只(河北省实验动物中心提供)，随机分为4组：3个不同酒精剂量(2.7、4.5、7.5 g/kg)的处理组和对照组，每组10只。各酒精处理组均用无水乙醇加入不同量蒸馏水灌胃，灌胃量为15 ml/kg，对照组给予等量蒸馏水，每日1次，连续13周。于末次染毒24 h后用乙醚麻醉动物，眼眶采血后处死，取双侧睾丸，称重，分别进行睾丸的形态学观察、流式细胞仪检测及Western blot检测。

1.2　观察指标及方法

1.2.1　睾丸形态学观察　取一侧睾丸，4％多聚甲醛固定，常规制备HE切片，光镜下观察生精细胞形态结构。

1.2.2　TUNEL法检测生精细胞凋亡　睾丸组织经4％多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片。按照试剂盒(由德国宝灵曼公司提供)说明书操作，标记前用DNA酶处理切片做阳性对照，用标记液代替TUNEL反应液做阴性对照。阳性细胞核和(或)细胞碎片呈深浅不一的棕黄色。

1.2.3　流式细胞仪检测睾丸各类生精细胞的构成和细胞凋亡率　取睾丸组织，剪碎，70％冷乙醇固定。制成单细胞悬液。检测条件：Epics_XL Ⅱ型流式细胞仪，激发光源15 mW氩离子激光器，激发波长488 nm。每个样本检测104个细胞，细胞荧光信号被送入ND_64多道脉冲仪，同时经计算机绘出DNA组方图，并计算出不同倍体细胞的百分比。在DNA组方图出现低于G1期DNA含量的亚G1峰的大小则代表凋亡细胞的多少，同时计算凋亡百分率。

1.2.4　Western blot 法检测睾丸组织中Caspase_3和PCNA的表达　取各组实验大鼠睾丸组织约100 mg加入裂解液100 μl提取蛋白，用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度(mg/ml)，－80 ℃保存。每个样品取50 μg总蛋白， 8％SDS_PAGE凝胶电泳后电转移至PVDF膜,5％脱脂奶粉37 ℃封闭2 h，再分别加入大鼠Caspase_3单克隆抗体或抗PCNA单克隆抗体(Santa Cruze 公司,美国)1:200稀释，4 ℃过夜。ECL化学发光法显色， LabWorks 4.5软件(美国UVP公司)对条带进行定量分析，确定杂交条带的相对吸光度值。

1.3　统计学方法

　　应用SPSS10.0统计软件处理数据，显著性检验采用Dunnet't检验，以α=0.05为检验水准。

2　结　果

2.1　睾丸的组织病理学观察

　　在光镜下对照组睾丸生精上皮呈规则圆形，排列紧密，结构清晰，层次分明，精原细胞大而圆，规则地紧贴曲细精管的基底膜，由外向内依次为初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞、精子。酒精组睾丸的曲细精管有不同程度的损伤，表现为某些生精细胞核固缩、变性，精子细胞变态期核固缩，同时曲细精管腔中脱落细胞增多。

2.2　睾丸组织中各类生精细胞的构成和细胞凋亡率

　　TUNEL法检测睾丸组织中的生精细胞凋亡，各酒精组均可见凋亡的生精细胞，以7.5 g/kg组为最多。凋亡的细胞核染成深棕色，大多数凋亡的生精细胞为初级精母细胞，其次为圆形的精子和精原细胞，支持细胞、间质细胞和血管内皮细胞未见凋亡发生；对照组仅见极少数的凋亡细胞散在分布。

　　流式细胞术分析的细胞直方图显示，睾丸组织主要由以下几类细胞组成，按其DNA含量排列在相应的峰道内，AP峰(凋亡细胞)，1C峰(单倍体DNA细胞峰，即精子细胞和精子)，2C峰(二倍体DNA细胞峰，包括次级精母细胞、G0期精原细胞和间质细胞、支持细胞等)，4C峰(四倍体DNA细胞峰，包括初级精母细胞和G2期精原细胞等)。各组睾丸中各类细胞的构成和细胞凋亡率见表1，经方差分析，酒精4.5、7.5 g/kg组大鼠生精细胞凋亡率明显高于对照组，1C峰和4C峰细胞构成明显低于对照组(P<0.05)。

　　Western blot检测各组睾丸组织中Caspase_3和PCNA的表达，由图1所示。对照组大鼠睾丸Caspase_3表达很弱，酒精组尤其是4.5、7.5 g/kg组Caspase_3表达较对照组明显增强(P<0.05，P<0.01)；各酒精组大鼠睾丸PCNA表达较对照组减弱，其中7.5 g/kg组PCNA表达明显低于对照组(P<0.05)。

3　讨　论

　　细胞增殖和细胞凋亡的动态平衡是维持机体稳态的一种重要方式。 睾丸内精子发生是一个复杂的过程，其中存在多种调节机制，正常情况下，生精细胞的凋亡与增殖维持着动态平衡，从而调节精子发生和异常生精细胞的清除。生理状态下的生精细胞凋亡是机体清除增殖过程中染色体复制发生错误或恶变的细胞，使生精细胞数量保持相对稳定的一种机制，因此正常的精子发生过程中就存在自发的生精细胞凋亡。然而过度凋亡则会造成生精细胞数量减少，生育力下降，许多生殖疾病都与生精细胞的凋亡变化有关[4]。

　　本研究表明，大鼠摄入酒精连续13周，睾丸生精细胞退化变性、凋亡增多，且随着酒精剂量的增大，生精细胞凋亡率显著增加，酒精组大鼠睾丸中Caspase_3表达增强， Caspase_3是凋亡途径下游进行底物酶解的关键蛋白酶，是凋亡的效应分子和执行者[5]。说明酒精可以诱发生精细胞过度凋亡。应用流式细胞术分析细胞DNA含量进行单细胞分类定量检测, 显示单倍体细胞群和四倍体细胞群数量显著减少。提示酒精致生精细胞凋亡主要发生在精子细胞和初级精母细胞。

　　核增殖抗原PCNA是DNA聚合酶δ的附属蛋白,为DNA复制起始所必需,具协同DNA前导链和后随链的合成、增加DNA聚合酶延伸DNA链的功能。其含量的变化与DNA合成密切相关,它在细胞DNA静息期(G1后期)开始出现,DNA合成期(S期)和合成后期(G2期)逐渐升高,有丝分裂期(M期)达高峰,有丝分裂结束后,则迅速降解消失,因此被认为是能较可靠反映细胞增殖活性的客观指标[6]。D'Andrea等[7]认为PCNA在一定程度上可作为反映睾丸生精功能、评价睾丸毒性的一个重要指标。本研究结果显示4.5和7.5 g/kg酒精组动物生精细胞PCNA表达减弱, 说明酒精抑制了生精细胞的增殖能力。

　　因此，酒精在诱导生精细胞凋亡增加的同时伴随着增殖能力的减弱, 二者的平衡被破坏可能是长期摄入酒精导致生精功能障碍的一个重要原因。

参考文献

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[2] Emanuele MA， Emanuele N. Alcohol and the male reproductive system [J]. Alcohol Res Health, 2001,25(4):282－287.

[3] 张　莉，朱伟杰. 睾丸生精细胞凋亡调控机制研究进展[J]. 生殖与避孕，2005，25(4)：230－232.

[4] Shaha C. Modulators of spermatogenic cell survival [J]. Soc Reprod Fertil, 2007,63(Suppl):173－186.

[5] Hotchkiss RS, Strasser A, McDunn JE, et al. Cell death [J]. N Engl J Med, 2009, 361(16): 1570－1583.

[6] Naryzhny SN. Proliferating cell nuclear antigen: a proteomics view[J]. Cell Mol Life Sci, 2008,65(23):3789－3808.

[7] D'Andrea MR, Lawrence D, Nagele RG, et al.  PCNA indexing as a preclinical immunohistochemical biomarker for testicular toxicity[J]. Biotech Histochem,2008,83(5):211－220.

收稿日期： 2010－04－30； 修订日期： 2010－05－07

基金项目： 河北省卫生厅医学研究重点课题(08253)

作者简介： 解丽君(1972－　)，女，河北赵县人，副主任医师，研究方向：生殖毒理与药物毒理。

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