海春旭/陈宏莉(综述)/邹伯英(审校)

(第四军医大学军事预防医学系军事毒理学教研室，陕西 西安 710032)

　　【摘要】 光气是一种经典的化学战剂，也是化学恐怖袭击的重点选择对象。同时光气又是一种重要的化工原料，广泛应用于高分子材料、农药、医药、香料和染料等领域，在生产、储存、运输过程中的意外事故造成的光气泄漏，极大威胁人民生命财产安全，这些使得光气一直是各国学者的研究热点。光气中毒主要引起难治性肺水肿，死亡率极高，目前世界上没有有效的救治方法和药物，主要是由于对其中毒机制不清楚。我们实验室多年来一直从事窒息性毒剂肺损伤机制研究，近年来取得了一些发现性的成果，提出了光气的酸烧伤理论，同时就氧化损伤_呼吸爆发等机制进行了一定的研究，本文将就光气部分最新研究进展做一综述。

　　【关键词】 光气； 肺损伤； 氧化应激； 呼吸爆发； 炎症

　　中图分类号： R114，R99　　　　文献标识码： A　　　　文章编号： 1004－616X(2010)05－0401－03

　　光气(COCl2)，化学名为二氯碳酰，是致死性化学武器中的重要战剂，也是化学恐怖威胁的化学毒剂之一。同时，光气也是重要的化工原料，广泛应用于高分子材料、农药、医药、香料和染料等领域，尤其是用于合成性能优良的工程塑料聚碳酸酯和聚氨酯原料。由于它是剧毒性气体，在使用、运输和贮存过程中存在极大的危险性，2005年美国环保署(U.S. Environmental Protection Agency)的白皮书认为，光气是目前中毒机制不清、缺乏有效救治手段的重要化学毒剂[1]。目前全世界光气的储备大约有230万吨。自光气问世并作为军用战剂的近百年来，光气中毒救治方法始终未能取得突破，关键是光气的中毒机制不清楚。由于光气在战争、恐怖袭击、工业泄露等方面的巨大威胁性，国际上对其研究的热情始终不减，其重点在于光气中毒机制研究。

　　长期以来，关于光气急性中毒机制始终存在争论。其中占主导学说的是酰化理论，近几年来氧化应激损伤学说、酸烧伤理论等也有一定的影响。光气是酰氯类化合物，活性基团是羰基，化学性质非常活泼，容易与亲核物质如组织大分子中的氨基、巯基、羟基等重要功能基团发生酰化反应，生成盐酸，从而引起蛋白和脂质的破坏，膜结构的不可逆改变，酶和其他细胞功能的瓦解[2]。同时，光气损伤还可以引起脂质过氧化，这主要是由于光气损伤中诱发炎症反应，引起呼吸爆发，导致活性氧(reactive oxygen species,ROS)的大量产生[3－6]。最新研究还发现，致死浓度的光气中毒，二氯碳酰的碳酰基与水可以快速生成盐酸等酸性产物，肺泡表面pH值降低，血液pH值也显著降低，给予碱性药物既可有效预防，又能在中毒早期发挥救治作用，因而形成了光气急性中毒的早期酸烧伤发生机制[7]。除此之外，还有如“肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤与调亡”学说以及“钙离子内流损伤”学说等[8]。本文中将就光气的盐酸烧伤机制及炎症呼吸爆发机制做一综述。

1　致死剂量与亚致死剂量光气中毒损伤的“哑铃型”机制

　　大量测定结果表明，致死剂量和亚致死剂量光气中毒的临床表现有其显著特点：致死剂量光气中毒表现为酸烧伤闪电式损伤致死；亚致死剂量光气暴露后，表面上看不出损伤，但在暴露后6 h，95％以上的患者会突然出现呼吸障碍，救治不当就会死亡；如果中毒患者能够在48 h内度过“死亡威胁”，绝大多数患者的窒息性症状也会逐渐消失、自愈。即亚致死剂量光气中毒后出现一个特征性的潜伏期。所以光气暴露后或者立即死亡，或者经历一定时间的潜伏期而再次出现严重肺损伤导致死亡，这种时间与症状“两头重”的逐渐移行变化过程(闪电式死亡－潜伏期－呼吸爆发)非常类似“哑铃型”， 被形象比喻为“哑铃型”机制，成为光气中毒的突出特点[9－12]。

　　闪电式死亡：当肺泡暴露于致死性剂量的光气冲击时，肺泡表面发生水分子与光气快速反应，生成大量盐酸分子，在1～2 min之内，溶解肺泡及气管表面活性物质，使盐酸分子直接接触肺泡壁，肺组织来不及启动各种防御机制，肺泡就出现溶解性“空洞”、造成结构性损伤，血浆、血液系统有形成分以及组织液大量流出到肺泡，充满液体的肺泡腔使肺泡失去了换气功能，造成窒息性死亡[9]。

　　潜伏期：当光气暴露剂量低于致死剂量的光气时，机体就会立即启动损伤的防护与修复机制，存在于肺泡局部的巨噬细胞、中性粒细胞通过趋化因子作用，向肺泡表面损伤部位移动，同时释放炎症介质和自由基及ROS，存在于局部的抗氧化酶发挥抗氧化动能，清除自由基与ROS，修复细胞损伤，并开始启动、活化炎症、氧化还原信号系统。这时的机体表现为暂时性的“平静”，肺窒息性症状不明显，处于继发性损伤的“潜伏期”[9]。

　　发现这种"哑铃型"中毒机制与表现，具有非常重要的临床意义，为中毒患者的病情判断和救治，提供了科学依据。

2　致死剂量光气中毒发生酸直接烧伤是中毒早期致死的主要机制

　　光气中毒的特效药物、特效救治研究，已经持续了近1个世纪，降低中毒病死率这个最重要的指标，成为最难攻克的医学堡垒之一。光气与生物大分子的反应式如下：

　　COCl2＋2R－NH2 →CO(NH－R)2＋2HCl

　　我们研究发现，在上述光气与氨基化合物发生反应的方程式中，酰化作用是重要的，但在反应中生成的盐酸(HCl)对肺泡上皮直接烧伤作用更重要。光气微溶于水，但是一旦溶解，可迅速水解为CO2和HCl, 其半衰期在37 ℃ 时约为0.026 s。由于HCl引起刺激和组织损伤，眼睛、鼻咽和呼吸道黏膜也有可能出现HCl烧伤。我们实验发现光气染毒的生理盐水和染毒后的肺泡灌洗液呈现强酸性，pH值达到1～2。同时我们对比了HCl吸入肺损伤与光气吸入肺损伤，结果发现光气肺损伤与HCl肺损伤极其相似。采用弱碱性缓冲液(NaHCO3)雾化吸入和腹腔注射，均能显著降低中毒病死率[7，13－15]。因此，酸直接烧伤机制的发现，对于光气中毒的急救具有重要的指导意义。

3　呼吸爆发_氧化应激是亚致死剂量光气中毒损伤的重要机制之一

　　我们的大量实验研究表明，光气染毒早期烧伤作用会激发炎症反应，引发呼吸爆发，释放大量的炎症介质和自由基，造成机体氧化应激，促进肺泡和肺血管损伤，组织液大量渗出，是肺水肿发生的重要机制之一。

3.1　光气染毒引起呼吸爆发

　　呼吸爆发(respiratory burst)是指吞噬细胞在聚集、活化和吞噬过程中，其富有的NADPH氧化酶和NADH 氧化酶可催化摄取的氧接受电子，快速释放大量ROS包括、·OH、H2O2、1O2，用以杀灭微生物及外来异物，同时伴有耗氧量的增加，这一现象称为呼吸爆发或氧爆发。呼吸爆发(呼吸链反应)也是产生氧自由基的重要来源，自由基作用与体内呼吸爆发机制有关。当中毒、损伤、缺血再灌注等因素作用下，细胞因子大量释放，通过扳机样作用触发中性粒细胞和单核巨噬细胞等释放大量的髓过氧化物酶，导致炎症介质包括自由基大量释放，产生瀑布样级联反应[16]。

　　我们的研究结果证明，光气染毒后,引起大量中性粒细胞和单核巨噬细胞移行至肺泡表面，髓过氧化物酶与肺水肿呈现平行增加，解剖动物肺脏做病理检查，可见具有大量渗出样改变和肿胀性坏死，肺脏湿/干比值增大。炎症因子TNF_α和白介素_1β显著升高，表明光气引发肺水肿与呼吸爆发_氧化应激造成肺泡和肺血管损伤有关[17－18]。

　　给染毒动物注射特异性呼吸爆发阻断剂环磷酰胺或氯化钆，可显著降低循环中性粒细胞的数量，减轻肺内中性粒细胞的移行，抑制中性粒细胞的“呼吸爆发”，炎症损伤介质显著减少，使肺水肿减轻，动物死亡率大大降低。这些结果充分证明了呼吸爆发在光气引起肺损伤致死过程中的重要作用[19]。

3.2　光气染毒引起呼吸爆发导致氧化应激

　　光气染毒，引发呼吸爆发的同时，氧化应激损伤指标显著增加，肺组织和肝组织匀浆以及血丙二醛(MDA)水平显著升高。抗氧化酶如过氧化氢酶(CAT)活性明显降低，并与呼吸爆发相关指标变化相一致；同时，肺组织MDA含量变化与肺水渗出程度存在剂量效应关系。不仅如此，采用抗氧化治疗和碱缓冲液治疗，均能有效改善呼吸爆发_氧化应激相关指标，肺水渗出得到显著抑制[13－14,20]。

　　光气染毒后，测定含铜锌超氧化物歧化酶(CuZn_SOD) 和含锰超氧化物歧化酶(Mn_SOD) 随时间变化情况。发现光气染毒后1 h，CuZn_SOD和Mn_SOD蛋白及mRNA表达均未见显著改变，到3 h后Mn_SOD表达显著升高，而CuZn_SOD始终未见显著改变。染毒后6 h经治疗后CuZn_SOD 和Mn_SOD的表达以及总SOD活性显著降低。这可能是由于光气染毒后引发自由基反应，体内SOD表达代偿性增加，而SOD的增加本身也增加了体内H2O2含量，因此其高表达对肺组织损伤恢复并非是有益的。CAT是体内唯一直接分解H2O2的酶，我们发现在染毒后肺组织中CAT表达逐渐降低，经治疗后其表达及活性显著升高，这可能是对抗SOD产生过多的一种机制[17]。这些结果显示，呼吸爆发_氧化应激损伤是肺水肿发生的重要机制之一。

　　Nrf2(nuclear factor_erythroid related factor 2)是一种转录因子，在氧化应激应答中起核心调控作用。在正常生理条件下，Nrf2与Keap1偶联被封闭在细胞质中，以阻止Nrf2向细胞核中转运和活化。在ROS作用下，Nrf2与Keap1锚定蛋白解偶联，进入细胞核而发挥调控下游抗氧化相关酶表达作用。Nrf2在细胞核中与小Maf蛋白形成异二聚体复合物，通过与ARE/EpRE的特殊位点结合从而调节ARE/EpRE激活下游抗氧化酶基因的表达。我们的研究结果表明，光气染毒后肺组织中Nrf2表达在染毒后1 h已显著降低，后逐渐升高。表明，在光气染毒后Nrf2表达受到抑制，可能影响Nrf2蛋白的翻译、合成，或者增加其降解。由于Nrf2调控下游抗氧化酶的表达，因此，其下游酶CAT表达亦显著降低，两者趋势一致。当光气染毒给予治疗后发现肺组织中Nrf2表达显著升高，与之相一致的是CAT表达亦显著升高[17]。提示Nrf2通路很可能在光气引起的氧化应激中发挥着重要作用。

3.3　亚致死剂量光气中毒呼吸爆发的调控机制

3.3.1　MAPK信号通路　丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)是广泛表达的丝氨酸/酪氨酸激酶，在哺乳动物细胞多种信号转导通路中起重要作用。MAPK有4个主要亚族：ERK、p38MAPK、JNK和ERK5。其中p38信号通路是MAPK通路的一重要分支，它在炎症、细胞应激、凋亡、细胞周期和生长等多种生理和病理过程中起重要作用。我们的研究表明，MAPK信号通路参与光气中毒的促炎反应，p38信号通路是促炎介质释放重要步骤。光气染毒后，大鼠肺组织中p38磷酸化水平随时间逐渐升高。这与炎症因子在肺组织中的表达趋势一致，提示在光气染毒过程中，p38活化可能参与了炎症的爆发过程。在光气染毒大鼠模型中我们给予治疗后发现，p38磷酸化水平较阳性对照组显著降低。同时，TNF_α、IL_1β等炎症因子表达降低，肺组织中炎症反应减轻。这与治疗后肺水肿症状缓解趋势一致，表明通过降低p38磷酸化水平，抑制p38信号通路可能是减轻光气致急性肺损伤中炎症反应的机制之一[17]。

3.3.2　NF_κB的核转位在光气中毒中有重要作用　核因子_κB(NF_κB)是一种重要转录因子，具有多功能转录与调节作用。活化的NF_κB能与多种基因启动子或增强子上面的特异性的κB部位发生结合，促进这些基因的转录和表达。几乎存在于所有细胞中，对细胞的生长、分化、黏附及炎症反应具有重要的调节作用。当细胞未受到刺激时，细胞中的NF_κB处于未活化状态，不具有调节转录的能力。此时，NF_κB与一类被称为I_κB的抑制蛋白结合在一起，位于细胞质中，并且其p65被封闭，不能被p65抗体识别。当细胞受到细胞外信号刺激时，I_κB发生磷酸化降解，NF_κB与I_κB发生解离，NF_κB迅速从细胞质移位到细胞核，在核内与目的基因，如编码iNOS、COX2、TNF_α等基因上的κB位点特异性结合，从而促进相关基因的转录。此时p65能够被抗p65的抗体识别。我们的结果表明，NF_κB在光气染毒后1 h在细胞核中的含量迅速升高，后逐渐降低。这表明光气染毒可以造成NF_κB的核转位，这可能是光气引发炎症反应的重要途径之一。这提示对NF_κB途径的有效抑制可能为光气治疗提供新的途径[17，23]。

3.3.3　HMGB1是炎症早期启动晚期效应介质　高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1，)HMGB1目前被认为是一种晚期介质。有研究表明，在LPS诱导的细胞因子介导的系统性炎症动物模型中作为一个内源性的DNA结合蛋白。HMGB1在内毒素刺激12～18 h后由巨噬细胞分泌。HMGB1的细胞因子活性包括刺激TNF_α、IL_1和其他来自于垂体细胞的炎症产物，对平滑肌细胞产生趋化，介导急性肺损伤和死亡。利用抗HMGB1的抗体有效抑制了内毒素肺损伤引起的死亡。这些延迟的动力学和体内抗HMGB1抗体的保护作用表明HMGB1是致死的系统性炎症的迟发因子。这可能为脓毒症或其他系统性炎症反应提供更宽的治疗窗口。HMGB1基因启动子部位具有NF_κB结合位点，可以被NF_κB激活转录。我们的研究发现，光气染毒后HMGB1虽有延迟释放的特征，但在染毒后6 h已经达到其峰值。这表明光气染毒造成的急性肺损伤不同于内毒素引发的急性肺损伤，HMGB1具有不同的动力学特征。这可能是因为光气是一种致死性毒气，主要死亡时间集中在24 h以内。且光气引发的酸烧伤造成肺泡细胞在短时间内大量死亡，从而使HMGB1瞬时大量从肺细胞中释放。治疗药物可以显著抑制组织中HMGB1的释放，从而在多种疾病模型中作为HMGB1的抑制剂应用于在更宽的窗口期治疗炎症反应。而实验证明治疗药物对于HMGB1的抑制最终是由于其对NF_κB活化的抑制发生的。我们的研究发现治疗后肺组织及肺泡灌洗液中HMGB1含量显著降低，与其对NF_κB活化的抑制趋势一致。提示光气染毒治疗后，其对NF_κB通路的抑制导致了HMGB1分泌的减少，从而减轻了肺组织炎症反应[17, 24]。

3.4　磷脂酶A2_ⅡA是肺泡和血管损伤的关键调控因子

　　分泌型磷脂酶A2_IIA(secretory phospholipase A2_IIA，sPLA2_IIA)又称血小板型PLA2，分子量大约为14 kDa，sPLA2_IIA 因为能催化磷脂水解，促使前列腺素、白三烯等炎症介质形成而在炎症过程中发挥重要作用。肺泡表面活性物质中最主要的成分二棕榈酰卵磷脂(DPPC)被sPLA2_IIA水解后产生的溶血卵磷脂(lypo_PC)对肺有明显的损伤作用。lypo_PC不但可以增加毛细血管的通透性，影响表面活性物质降低表面张力的活性，还对淋巴细胞和单核细胞具有趋化作用，促进粘附分子的表达，参与了炎症反应中炎细胞的聚集。我们前期的研究表明，光气染毒后sPLA2_IIA活性增强，在6 h达到峰值[25]。有研究表明HMGB1与sPLA2_IIA之间存在调控关系。在IL_1β致敏的血管平滑肌细胞中，HMGB1可以增强sPLA2_IIA的活性以及前列腺素E2(PGE2)的产生[26]。我们发现光气中毒给予药物治疗后大鼠肺组织及肺泡灌洗液中sPLA2_IIA活性显著降低。治疗药物能够显著抑制HMGB1释放，降低抑制炎症反应的功能。提示光气很可能通过提高HMGB1水平提高sPLA2_IIA的活性，在光气急性肺损伤中发挥着重要作用[17, 24]。

4　结　语

　　综上所述，我们通过大量研究表明，光气致死剂量与亚致死剂量中毒具有“哑铃型”的特点。早期中毒致死机制主要以酸烧伤为主，呼吸爆发_氧化应激是潜伏期后肺损伤致死的重要机理之一。 而MAPK信号通路、NF_κB核转位、HMGB1和sPLA2_IIA均在呼吸爆发_氧化应激中发挥着重要的调控作用。调控这些靶分子的水平很可能有效的治疗光气引起的肺损伤，最终达到提高光气中毒救治率和救治效果的目的。

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收稿日期： 2009－10－28； 修订日期： 2010－06－28

基金项目： 全军十一五指令性课题(06Z038)；第四军医大学军事医学科研重大项目(08X22001)

作者简介： 海春旭(1955－　)，男，辽宁黑山县人，博士，教授，博士生导师。研究方向：防化医学与自由基毒理学。

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