何　江(综述)/蔡绍先/陈玮莹*(审校)

(汕头大学医学院，广东　汕头　515041)

【摘要】  p53是重要的肿瘤抑制基因，本文结合p53 蛋白的结构和功能，对于近年来有关p53在表皮黑素细胞和黑色素代谢中的作用，以及皮肤恶性黑素瘤(cutaneous malignant melanoma，CMM)中p53和p53通路相关蛋白的改变对黑素瘤发生发展影响的研究现状进行综述。

【关键词】  p53； 黑素细胞； 黑素瘤； 代谢

  中图分类号： R730.231     文献标识码： A     文章编号： 1004-616X(2011)02-0155-03     doi： 10.3969/j.issn.1004-616x.2011.02.018

p53是重要的肿瘤抑制基因，自从该基因在1979年被首次报道以来，有关研究论文在Medline上可查到上万篇。人们最初认为p53基因是一种癌基因，但随着近十年研究的深入，p53作为抑癌基因的功能逐渐被揭示出来，如阻滞细胞周期，促进细胞凋亡等。在正常黑色素细胞中，p53对黑色素的代谢起着重要的调控作用，P53蛋白不但与酪氨酸酶相关蛋白1(tyrosinase-related protein 1，TRP1)基因调控序列有清楚的结合位点，直接调控黑色素合成，而且还是黑素细胞和角质形成细胞之间信号通路的必需成员。因此目前人们侧重研究正常黑素细胞中p53对黑色素合成的影响。在恶性黑素瘤细胞中，虽然p53表达上调且突变率较低，但是p53很可能失活，p53失活的具体机制还不清楚。另外，目前研究表明黑素瘤恶变程度越高，p53阳性表达率也越高，这是与p53作为肿瘤抑制因子相矛盾的；对于其具体机制目前也不清楚。因此该领域尚有很多问题有待解决。我们对p53及相关通路蛋白在黑色素细胞和黑素瘤细胞代谢中的作用进行综述。

1　p53的结构及其功能

1.1　p53的结构

人类p53基因位于染色体17p13.1 ，全长16～20 kb ，含有11 个外显子和10个内含子，编码393个氨基酸，相对分子质量为53 kD的核磷酸化蛋白。野生型p53 蛋白可分为3部分。第1部分为含转录激活结构域和生长抑制结构域，定位于第1～95个氨基酸 的氨基末端，此区也是p53与小鼠双微染色体蛋白(murine double minute 2，MDM2)、可变阅读框编码的蛋白(p14arf)和p300结合的区域。第2部分是能与特异性识别的DNA序列结合的第102～292个氨基酸的中央核心区，p53的5个保守序列有4 个位于此区，这4个保守序列是此区功能执行的重要结构。第3部分为第300～393个氨基酸的羧基末端，含四聚体寡聚化结构域、非特异DNA结合区域及3 个核定位信号和1个核输出信号。

p53作为一种具有肿瘤抑制功能的核内转录因子，有多达70种功能。p53能活化20种不同的启动子，抑制26种不同的启动子和增强子，并能与多达35种胞内蛋白相互作用，对外界刺激产生应答，是维持基因组稳定、诱导细胞凋亡和促进损伤DNA修复的基础[1]。一旦p53发生突变或失活，将使靶基因稳定性减弱，引起基因扩增和DNA倍数改变。

1.2　p53与DNA修复及细胞周期停滞

研究发现，当细胞受到各种信号的刺激，例如紫外线(ultraviolet rays，UV)照射而引起DNA损害时，刺激信号将传递给一种作为p53上游调节成分的肿瘤抑制蛋白p14arf，p14arf直接结合于MDM2，使p53与MDM2的结合被阻断 [2]，从而阻止了P53蛋白由细胞核输出到细胞质；也阻止了p53蛋白经蛋白质泛素化降解途径降解，导致p53在细胞中积聚。p53将激活下游蛋白P21和DNA损伤诱导基因45(growth arrest and DNA damage-inducible gene 45，GADD45)的表达。p21可与增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)结合，阻止DNA的复制，从而使细胞周期停滞在G1期。 GADD45基因是p53的一个调控基因，主要参与受损DNA的核苷酸切除修复[3]。另外，p53 可与核苷酸切补修复过程中的解旋酶相结合而参与DNA损伤的修复；p53还可利用自身的3’-5’核酸外切酶活性，在DNA修复中发挥作用。

1.3　p53和细胞凋亡

p53可上调线粒体蛋白的表达，例如BAX(Bcl-2-associated X protein)，PUMA(p53 upregulated modulator of apoptosis)， NOXA (phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1)蛋白[4]，并活化死亡受体介导的凋亡通路。PUMA和NOXA属于Bcl-2家族，主要的功能是促使细胞色素C从线粒体释放，细胞色素C与凋亡蛋白酶活化因子1(apoptosis protease-activating factor，APAF1)形成Apaf复合物从而激活Caspase9。其次，p53能刺激死亡受体的表达，例如Fas，从而激活细胞凋亡通路。

在许多肿瘤细胞中，由于p53突变，以及p53抑制因子的过表达(如Mdm2，Mdm4)和上游活化因子p14ARF和p21INK4a的失活或丧失。最后导致野生型P53蛋白活性减弱，细胞不再凋亡而无限增殖。最终导致肿瘤发生。

2　p53与正常黑色素细胞的代谢

2.1　p53参与黑色素合成

紫外线可以诱导p53活化。在黑色素细胞中，UV应答基因也是p53潜在的目的基因，包括酪氨酸酶和酪氨酸相关蛋白1等基因。 研究表明，黑色素细胞被紫外线照射后，由于p53表达上调使酪氨酸酶和酪氨酸相关蛋白1等与黑色素合成相关的基因表达上调。不过，目前尚未发现酪氨酸酶基因调控序列上的p53结合位点[5]。但另一个与黑色素合成有关的蛋白——酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1)的基因调控序列则有明确的p53结合位点。

2.2　p53与色素沉着

p53与色素沉着密切相关。紫外光照射会刺激角质形成细胞中p53蛋白表达上调，从而促进角质形成细胞中多种细胞因子如阿黑皮原(proopiomelanocortin，POMC)的表达增加，后者可以与黑色素细胞表面的受体结合而促进黑色素细胞增殖和黑色素合成，最后导致色素沉着。

最近有报道指出，皮肤色素沉着部位的角质形成细胞中与黑色素合成相关的内皮素(endothelin，ET)和干细胞因子(stem cell factor，SCF)的表达高于其他组织 [6-7]。Daiki Murase通过免疫组化和RT-PCR检测发现在色素沉着部位p53的表达和磷酸化水平增加，伴有与黑色素合成相关的细胞因子SCF，ET1以及POMC的表达增加[8]。另外，用p53 siRNA处理培养的组织和小鼠会使ET和SCF的表达下调[8]。这些结果提示，相关细胞因子表达增加可能与p53被激活和表达上调有关，皮肤色素沉着可能是由于角质形成细胞中p53活化和表达上调所引起。

p53的激活和上调使上述细胞因子表达增加的原因，很可能是这些细胞因子基因上有p53蛋白的结合位点，p53的活化和上调表达激活了这些基因的转录。例如Cui等[9]发现角质形成细胞中p53与POMC基因调控序列结合能激活POMC基因的转录，最终导致POMC表达增加。ET1家族成员ET2也存在p53的调控元件，在紫外线照射后有可能从角质形成细胞中释放出来。有趣的是，有学者发现c-Met受体(配体HGF)基因也有p53的调控序列。

3　p53通路与黑素瘤细胞的代谢

3.1　p53在黑素瘤中的表达

人们发现p53与黑素瘤的恶化程度有关，恶性程度越高，p53表达的阳性率越高。有报道称33%的痣、35%的早期黑素瘤、70%转移性黑素瘤中p53呈阳性 [10]。说明p53的上调表达可能与黑素瘤的恶化程度有关。p53在通常意义上是作为肿瘤抑制因子，这与此现象相悖。那么黑素瘤细胞中的p53是突变型的，还是失活的呢？许多学者对黑素瘤细胞中p53基因进行了研究和分析，发现p53基因突变频率较低，大多为野生型。

既然黑素瘤中p53大多为野生型，那么很可能有其他的机制使p53失活。研究发现，p53的羧基末端被切断可生成p53亚型，某些p53亚型如Δ40p53 (p47)和Δ133p53在黑色素细胞转化过程中表达；并且可以抑制黑素瘤中p53介导的转录和凋亡[11]。

3.2　MDM2的表达及其与p53的关系

黑素瘤细胞中，p53大多是野生型的，而且表达上调，而p53的上调会引发MDM2的表达上调，这种表达上调很少涉及MDM2基因座的扩增。研究表明，6%的痣﹑27%的原位黑素瘤、 56%的转移性黑素瘤中MDM2表达上调[12]。

MDM2的上调从理论上应该被视为肿瘤恶化的标记，因为MDM2也是p53蛋白的抑制因子。但统计学分析发现，MDM2的上调表达与病情改善相关[13]，其他类型肿瘤也有相似结果，在这些肿瘤中p53和MDM2的表达都很高。因此，p53和MDM2的代谢与肿瘤预后的相关关系，仍需通过进一步研究加以阐明。

3.3　INK4和ARF的表达对P53的作用

某些与P53蛋白功能密切相关的肿瘤因子如INK4和Arf的失活或丢失也可能与黑素瘤的发生发展密切相关。INK4和Arf 基因位于染色体9p21。该基因座编码3个肿瘤抑制因子：INK4a(CDKN2A或p16INK4a)，INK4b(CDKN2B)和ARF(在鼠科中称之为p19ARF，在人类则称为p14ARF )[14]。INK4a和ARF有3个外显子编码，第1个外显子各不相同，而第2和第3个外显子相同。

目前已知，p16INK4a/p19ARF能活化不同的抗肿瘤通路。p14ARF能与MDM2结合，抑制P53蛋白泛素化，从而使得p53稳定和活化[15]。而p16INK4a则是CDK4相关蛋白，可以不依赖p14ARF而单独活化p53；该蛋白还抑制CDK4介导的Rb磷酸化，从而活化Rb并阻止Rb家族成员p130和p107的磷酸化[16]。由此可见p16INK4a/p19ARF是p53重要的上游分子。

如果p16INK4a/p19ARF基因缺失或某些片段丢失，将促使黑素瘤的发生和恶化。例如一旦p16INK4a/p19ARF外显子2和外显子3丢失，将促进Ras在黑素细胞中过表达，从而促使黑素瘤的发生。在大约50%的肿瘤和所有的黑素瘤细胞株中，都发现INK4a/ARF发生杂合性缺失。50%至70%的恶性黑素瘤中p16INK4a/p19ARF蛋白表达出现杂合性缺失[17]。在另外一些家族性黑素瘤中，却发现只有p14ARF基因缺失，说明p14ARF是黑素瘤中独立的易感基因。

除此之外，如果p16INK4a碱基缺失，点突变，以及启动子甲基化而丧失表达，也将会促使黑素瘤的发生发展。尤其是在家族性黑素瘤中发现p16INK4a基因发生点突变；此外，在可遗传的和偶发性的黑素瘤中也发现该基因经常发生改变[15]。

3.4　APAF1和PUMA在黑素瘤中的表达和功能

许多细胞凋亡因子基因启动子区都有p53蛋白反应元件，例如凋亡蛋白酶活化因子1(APAF1)和p53上调凋亡调控物(PUMA)，p53可以促使APAF1上调表达。APAF1是线粒体凋亡通路和多聚凋亡体通路的关键性调控因子。APAF1和Caspase9结合并使 Caspase9被剪切激活，活化的Caspase9激活Caspase3，从而介导细胞凋亡级联反应。在正常黑色素细胞、痣、黑素瘤中，APAF1的表达均呈阳性，但早期黑素瘤中APAF1的表达水平比痣的APAF1低[18]。在恶性黑素瘤中，在多达42%的黑素瘤中APAF1杂合性缺失。APAF1作为p53依赖介导凋亡的关键性成分，它的缺失会使黑素瘤细胞避开凋亡而得以生存。其他的研究曾报道APAF1在早期黑素瘤中的表达量高于恶性黑素瘤[18]。因此APAF1表达的丧失与黑素瘤的恶化密切相关。

p53调控的另一个与细胞凋亡有关的基因是PUMA基因。PUMA是一种BH3-only线粒体蛋白质，属于Bcl-2蛋白家族成员。当PUMA表达时，诱导细胞色素C释放，并且激活Caspase3和Caspase9酶原，快速引起细胞的凋亡和生长抑制。很多研究表明在黑素瘤恶化过程中，PUMA是沉默的，但该基因沉默的机制目前尚不清楚。

4　结　语

p53通路主要成员的改变对正常黑色素细胞代谢和黑素瘤发生发展是极为重要的。但是还有几个问题没有得到合理解释：一是为什么黑素瘤细胞中p53的表达会随着黑素瘤的恶化而上调；二是为什么黑素瘤中p53基因并没有像其他肿瘤那样会发生频繁的突变。因此对黑素瘤中p53通路机制更合理的解释还需要人们进一步的研究加以阐明。

参考文献

[1]　Levine AJ.p53，the cellular gatekeeper for growth and division[J]. Cell，1997，88 (3)：323-331.

[2]　Honda R，Yasuda H. Association of p19(ARF) with Mdm2 inhibits ubiquitin ligase activity of Mdm2 for tumor suppressor p53[J]. EMBO J，1999，18 (1)：22-27.

[3]　Korabiowska M，Brinck U，Betke H，et al. Growth arrest DNA damage gene expression in naevi[J]. In Vivo，1999，13 (3)：247-250.

[4]　Henry H，Thomas A，Shen Y，et al. Regulation of the mitochondrial checkpoint in p53-mediated apoptosis confers resistance to cell death[J]. Oncogene，2002，21 (5)： 748-760.

[5]　Khlgatian MK，Hadshiew IM，Asawanonda P，et al. Tyrosinase gene expression is regulated by p53 [J]. J Invest Dermatol，2002， 118 (1)：126-132.

[6]　Imokawa G，Kobayashi T，Miyagishi M，et al.The role of endothelin-1 in epidermal hyperpigmentation and signaling mechanisms of mitogenesis and melanogenesis[J]. Pigment Cell Res，1997，10 (4)： 218-228.

[7]　Akira H，Akemi K，Yasuko Y，et al. Biphasic expression of two paracrine melanogenic cytokines，stem cell factor and endothelin-1 in ultraviolet B-induced human melanogenesis[J]. Am J Pathol， 2004， 165 (6)：2099-2109.

[8]　Daiki M，Akira H，Yasuko A，et al. The essentional role of p53 in hyperpimentation of the skin via regulation of paracrine melanogenic cytokine-receptor signaling[J]. J Biol Chem，2009， 284 (7)：4343-4353.

[9]　Cui R，Widlund HR，Feige E，et al. Central role of p53 in the suntan response and pathologic hyperpigmentation[J]. Cell，2007，128 (5)： 853-864.

[10]  Sparrow LE，English DR，Heenan PJ，et al.Prognostic significance of p53 over-expression in thin melanomas[J]. Melanoma Res， 1995， 5 (6)：387-92.

[11] Avery-Kiejda KA，Zhang XD，Adams LJ，et al. Small molecular weight variants of p53 are expressed in human melanoma cells and are induced by the DNA-damaging agent cisplatin[J]. Clin Cancer Res，2008，14 (6)：1659-1668.

[12]  Polsky D，MelzerK，Hazan C，et al. HDM2 protein overexpression and prognosis in primary malignant melanoma[J]. J Natl Cancer Inst，2002，94 (23)：1803-1806.

[13] Berger AJ，Camp RL，Divito KA，et al. Automated quantitative analysis of HDM2 expression in malignant melanoma shows association with early-stage disease and improved outcome[J]. Cancer Res，2004，64 (23)：8767-8772.

[14] Kim WY，Sharpless NE. The regulation of INK4/ARF in cancer and aging[J]. Cell，2006，127 (2)：265-275.

[15] Kamijo T，Weber JD，Zambetti G，et al. Functional and physical interactions of the ARF tumor suppressor with p53 and Mdm2[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1998，95 (14)：8292-8297.

[16]  Helmbold H，Deppert W，Bohn W. Regulation of cellular senescence by Rb2/p130[J]. Oncogene，2006，25 (38)：5257-5262.

[17] Dahl C， Guldberg P. The genome and epigenome of malignant melanoma[J]. APMIS，2007，115 (10)：1161–1176.

[18]  Dai DL，Martinka M，Bush JA，et al. Reduced Apaf-1 expression in human cutaneous melanomas[J]. Br J Cancer，2004，91 (6)： 1089–1095.

收稿日期： 2010-07-08； 修订日期：2010-11-16

基金项目： 中华医学会－欧莱雅研究项目(S2010070806)

作者简介： 何　 江(1982- 　)，男，江西省萍乡市人，硕士研究生，研究方向：生物化学与分子生物学。Tel：0754－88900843

*Correspondence to：CHEN Wei-Ying，E-mail：wychen@stu.edu.cn

中华医学之家：http://www.xinxi85.com

投稿信箱：zhyxzj85@163.com

联系电话：029--85327298     主编QQ：693891972