早熟染色体凝聚最长染色体长宽比和最长与最短染色体长度比作为估算辐射剂量指标的研究

 

赵   骅/陆   雪/陈德清/封江彬/刘青杰*/苏   旭

(中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所，北京  100088)

 

Chromosome length to width　 ratio and length ratio as　 radiation biomarkers

 

ZHAO Hua, LU Xue, CHEN De-qing, FENG Jiang-bin, LIU Qing-jie*, SU Xu

(National Institute for Radiological Protection, China CDC, Beijing 100088, China)

 

【摘要】 目的： 用花萼海绵体诱癌素A(calyculin A，CA)诱导早熟染色体凝聚(premature chromosome condensation，PCC)，探索将G2/M-PCC细胞中最长染色体长宽比(L/B)和最长与最短染色体长度比(L/L)用于分析电离辐射损伤和作为估算辐射剂量指标的可行性。 方法： 分别用0、4、8、12、16和20 Gy(剂量率为1 Gy/min)的60Co γ射线照射外周血，培养48 h后用50 nmol/L CA诱导PCC。分析各射线照射剂量组G2/M-PCC指数，并进一步分析G2-PCC、M-PCC中L/B和L/L值的变化，建立L/B和L/L值与射线照射剂量之间的剂量-效应曲线。结果： 用CA可成功诱导人外周血淋巴细胞产生PCC，G2/M-PCC指数随着照射剂量水平的增高而降低(P<0.05)。G2-PCC、M-PCC分裂相中的L/B和L/L值在8~20 Gy范围内显著增大(P<0.05或P<0.01)，在同样照射剂量水平上L/L值较L/B值增加更快(P<0.05或P<0.01)。结论： CA诱导淋巴细胞G2/M-PCC中的 L/B和L/L值可用于电离辐射损伤程度的测定和作为估算辐射剂量的指标。

【关键词】 电离辐射; 早熟染色体凝聚; 最长染色体长度宽度比; 最长与最短染色体长度比

   中图分类号：R811.5；Q691    文献标识码： A    文章编号： 1004-616X(2011)02-0137-04    doi: 10.3969/j.issn.1004-616x.2011.02.013

 

【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To explore the feasibility of the longest chromosome length and width ratio (L/B), the longest and shortest chromosome length ratio (L/L)  in detecting the degree of radiation injury,  observed in calyculin A(CA) induced premature chromosome condensation(PCC). METHODS: Human peripheral blood samples were irradiated by 60Co γ-rays with the doses of 0, 4, 8, 12, 16 and 20 Gy, and cultured for 48 hours to obtain PCC with CA. The G2/M-PCC index at different doses was analyzed, and the L/B, L/L values were also calculated . The dose-response curve between L/B, L/L and absorbed dose were also established. RESULTS: PCC was successfully induced by CA, and the G2/M-PCC index was significantly decreased with dose level (P<0.05). The L/B and L/L values in G2-PCC or M-PCC were significantly increased at 8-20 Gy irradiation (P<0.05 or P<0.01), and L/L was higher than L/B at each dose level (P<0.05 or P<0.01).  CONCLUSION: The L/L and L/B values in peripheral blood G2/M-PCC cells induced by CA could be used to quantify the extent of ionizing radiation damage.

【KEY  WORDS】 ionizing radiation; premature chromosome condensation; the longest chromosome length and width ratio; the longest and the shortest chromosome length ratio

 

早熟染色体凝聚(premature chromosome condensation,  PCC)技术可以使间期细胞的染色体提前收缩，避免间期细胞死亡，可以克服在分析大剂量辐照淋巴细胞时因细胞死亡而导致的局限性，有望解决大剂量辐照后染色体畸变分析的难题[1]，获得可靠的生物剂量资料。最近国内外用蛋白磷酸酯合成酶抑制剂——冈田酸(Okada acid)或花萼海绵体诱癌素A(calyculin A,CA)， 使外周血淋巴细胞在G1、G2和M期发生PCC [2-5]， 解决了传统PCC技术需要细胞融合的繁琐步骤，使得PCC技术容易得到推广。本研究小组已建立用CA诱导G2/M-PCC的方法，分析不同剂量水平60Co γ射线照射外周血淋巴细胞PCC环水平，建立了相应的剂量-效应曲线[6]。本研究试图进一步探索PCC分裂相中最长染色体的长度和宽度比以及最长和最短染色体长度比作为辐射损伤指标的可行性。

 

1  材料与方法

1.1  血液样品

新鲜成年健康人外周血样品，肝素抗凝。供血者为非放射工作者、无急慢性疾病，半年内无射线和化学毒物接触史，无菌条件下各分装成6份，每份1.5 ml。

1.2  照射条件

用北京市辐照中心60Co源进行全血样品的γ射线照射。吸收剂量率为1 Gy/min，源皮距为73.5 cm，平均照射野为30 cm×40 cm，照射在室温下进行。剂量分别为0、4、8、12、16和20 Gy，剂量误差为±1%。照射后的血样在37 ℃温箱中孵育2 h，进行修复。

1.3  细胞培养、收获和制片

将修复2 h的全血0.5 ml加入4.5 ml RPMI-1640培养基(含20%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、0.2 mg/ml PHA)中，37 ℃恒温培养46 h后，加入CA(Sigma, USA)，使其终浓度为50 nmol/L，继续培养2 h后收获细胞。先用0.075 mol/L KCl在37 ℃条件下低渗10 min，再用甲醇:冰醋酸(V∶V=3∶1)预固定、固定细胞。制片时将细胞悬液滴在经无水乙醇处理、无尘纸擦洗干净的玻片上，湿热条件下使细胞和染色体均匀散开，空气干燥后用吉姆萨染色。

1.4  阅片

为获得G2/M-PCC指数，每个照射剂量组计数1 000个细胞中G2/M-PCC细胞的比例。然后每个剂量组分析50个G2-PCC或M-PCC细胞，用Meta System (Germany)中AxioVision Rel 4.6软件测量G2-PCC和M-PCC中最长染色体长度、宽度和最短染色体长度，如图1所示。

1.5  统计学方法

PCC指数(%)为每100个细胞中G2/M-PCC细胞的个数。最长染色体长宽比(L/B)为最长染色体长度/最长染色体宽度；最长染色体与最短染色体长度比(L/L)为最长染色体长度/最短染色体长度。应用SPSS 13.0软件进行分析，以α=0.05为检验水准。

2  结  果

2.1  60Co γ射线照射后淋巴细胞的G2/M-PCC指数

见表1。γ射线照射全血样品后，淋巴细胞中G2/M-PCC细胞的比例随着照射剂量的增加而降低(P<0.05)。将G2/M-PCC指数与照射剂量拟合曲线：二次多项式的方程为y =0.018 4x2-0.671 9x+6.667 9, R2= 0.988 8( y 为G2/M-PCC指数，x为剂量)；指数函数方程为y =6.881 8 e-0.134 4 x , R2=0.992 8(y为G2/M-PCC指数，x为剂量)。

2.2  γ射线照射后G2/M-PCC分裂相中L/B和L/L值

用0~20 Gy的60Co γ射线照射全血样品后，淋巴细胞中G2-PCC和M-PCC的形态非常容易区分，因此对各辐照剂量组G2-PCC和M-PCC的分裂相分别进行分析，结果见表2。

对于G2-PCC分裂相，随着剂量的增加，L/B值增大，8~20 Gy各辐照剂量组与对照组比较差别具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)，但12和16 Gy剂量组之间差别无统计学意义(P>0.05)。将照射剂量与L/B值拟合剂量-效应曲线，直线方程为y =0.122 2 x+3.226 2(R2=0.943 1)；二次多项式方程y =0.001 7x2+0.088 5x+3.316 1 (R2=0.949 2)， 见图2。L/L值在各辐照剂量组逐渐增大，与对照组间的差异具有统计学意义(P<0.01)，将照射剂量与L/L值拟合剂量-效应曲线，直线方程为y =0.261 2x+3.306 2 (R2=0.956 1)；二次多项式方程为y =0.001 9x2+0.222 8 x+3.408 6(R2=0.957 8)，见图3。

对于M-PCC分裂相，随着剂量的增加，L/B值也增大，8~20 Gy各辐照剂量组与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01)，但12、16和20 Gy剂量组之间的差别无统计学意义(P>0.05)。将照射剂量与L/B值拟合成剂量-效应曲线，为二次多项式方程y =-0.002 x2+0.102 4x +1.965 4(R2=0.950 8)，图2。L/L值随辐照剂量的增加逐渐增大，与对照组间的差异具有统计学意义(P<0.01)，而16和20 Gy剂量组之间的差异无统计学意义(P>0.05)；将照射剂量与L/L值拟合剂量-效应曲线，直线方程为y =0.321 1x+3.965 2(R2=0.956 8)；二次多项式方程为y = -0.001 7x2+0.354 8x+3.875 4(R2=0.957 7)， 见图3。

对于同样剂量水平的G2-PCC或者M-PCC，均是L/L 值比L/B值增加更快(P<0.05或P<0.01)；同时从拟合的剂量-效应曲线方程中，直线项斜率也可以看出此种变化趋势。

 

3  讨  论

1996年有研究用冈田酸诱导染色体发生凝聚，使得除G0期之外任何细胞周期的细胞发生PCC [7]。最近有研究利用I类和II类磷酸酶抑制剂CA诱导任一时相的细胞产生PCC，在培养24 h时获得标本，大大提高了获得结果的速度[8]，而且CA诱导PCC活性更高[5]。本研究在用CA进行外周血淋巴细胞PCC的诱导基础上，进一步探索PCC分裂相中最长染色体的长度和宽度比(L/B)以及最长和最短染色体长度比(L/L)作为辐射损伤指标的可行性。

PCC指数是评估化学因素诱导细胞发生PCC活性最有效的指标，在以往关于PCC指数分析时观察的是任一时相的所有细胞，但是G1和S期的PCC细胞界定非常困难，使得各项研究之间的结果不一致[5,7]。本研究中采用G2/M-PCC指数，因为在G2或M期的PCC有很明显的特征，提高了结果判定的准确性。本研究全血淋巴细胞中G2/M-PCC细胞的比例随着辐照剂量的增加而降低，0 Gy时G2/M-PCC指数为6.9%，20 Gy时下降到0.5%。

目前国内外对电离辐射诱导PCC的研究中，观察的指标有PCC环、断片、双着丝粒或总染色体畸变，有研究还建立了相应指标的剂量-效应曲线，大多证实PCC技术可以估算在大剂量辐照情况下的生物剂量，甚至达到40~60 Gy[4]。在日本东海事故中用PCC技术对3位受照者进行剂量估算，得到了初步验证[9]。目前用于估算剂量的PCC指标主要是PCC环、断片[10-11]，本小组前期的研究中观察G2/M-PCC细胞中的PCC环，结果证实用PCC环分析技术估算大于10 Gy照射的可行性[6]。本研究进一步探索用PCC分裂相中L/B以及L/L值作为辐射损伤指标的可行性。结果发现：无论G2-PCC还是M-PCC，L/B以及L/L值均随着照射剂量的增加而增大，并可较好地拟合曲线(直线或二次多项式方程)，证实这两种指标作为辐射损伤标志物的可行性，这与以前研究中用L/L值作为60Co γ射线和高传能线密度射线辐射损伤标志物相一致[12-13]。这两种PCC指标真正用于生物剂量的估算，还需要进行更加完善的研究和事故受照者的实践来检验。

 

参考文献

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收稿日期： 2010-10-22； 修订日期：2010-12-08

基金项目： 卫生行业科研专项(200802018)，国家自然科学基金项目(30570551、 30870749)

作者简介： 赵   骅(1986-   )，男，北京市人，实习研究员，研究方向：电离辐射生物效应。E-mail: zhaohua1234668@sina.com

﹡Correspondence to：LIU Qing-jie，E-mail: qjliu@nirp.cn

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