应用染色体G显带技术评估辐射剂量和染色体畸变的量效关系

 

施常备1/陈晓泉1/姚俊涛1/袁  勇1/赵  征1/袁  彬1/赵明刚2/陈  葳2/王  翔2,*

(1. 陕西省肿瘤医院，陕西   西安  710061； 2. 西安交通大学第一附属医院，陕西   西安  710061)

 

The value of G-banding chromosomal assay in ionizing-radiation-induced chromosomal aberration

 

SHI Chang-bei1， CHEN Xiao-quan1， YAO Jun-tao1， YUAN Yong1， ZHAO Zheng1， YUAN Bin1， ZHAO Minggang2， CHEN Wei2， WANG Xiang2,*

(1. Shaanxi Tumor Hospital, Xi’an 710061，Shaanxi;  2. First Affiliated Hospital of Medical College of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, Shaanxi, China)

 

【摘要】 目的： 应用染色体G显带技术观察4MV的X线辐射后的染色体畸变情况，分析不同类型的染色体畸变和辐射剂量的关系。方法： 以4MV的X线 0.5、1、2、4 Gy对离体人外周血进行辐照，其淋巴细胞培养后，采用染色体G显带分析不同类型的染色体畸变率。 结果： 染色体双着丝粒、缺失、易位以及片段畸变和辐射剂量呈线性正相关，其线性趋势线和R 2值依次分别为： Y=24.1X-13.3 (R 2=0.975)；Y=10.5X-2.7 (R2=0.887)；Y=30.2X-17.8 (R2=0.913)；Y=53.3X-38.7 (R 2=0.976)。 结论： 染色体G显带技术可以较非显带技术提供更多更准确的畸变信息，为进一步研究提供借鉴。

【关键词】  辐射；染色体畸变； G显带技术

   中图分类号： R144.1      文献标识码： A      文章编号： 1004-616X(2011)02-0134-03      doi: 10.3969/j.issn.1004-616x.2011.02.012

 

【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To validate the value of G-banding chromosomal assay in ionizing-radiation-induced chromosomal aberration.  METHODS:  Blood was irradiated with 0.5，1， 2 and 4 Gy，by 4 MV X-ray. The G-banding chromosomal aberration was assayed including dicentrics， deletions， translocations， rings， and fragments of chromosomes. RESULTS:  Chromosomal aberration rates of dicentrics， deletions， translocations， and fragments all showed linear increase with radiation dose，with correlations of Y=24.1X-13.3(R2=0.975)；Y=10.5X-2.7(R2=0.887)； Y=30.2X-17.8(R2=0.913)；Y=53.3X-38.7 (R2=0.976)，respectively. CONCLUSION: G-banding chromosomal aberration assay deserve more attention in radiation biology.

【KEY  WORDS】 radiation； chromosomal aberration assay； G-banding technique

 

 

 

生物染色体对电离辐射十分敏感，辐射导致的染色体畸变是辐射损伤机体细胞的主要表现，是评价机体辐射损伤程度的可靠依据。作者尝试应用G染色体显带技术分析辐射后的染色体畸变情况，评价辐射剂量和多种类型的染色体畸变的量-效关系。

 

1  材料与方法

1.1  材料

直线加速器(ELEKTA 1239)，显微镜(OLYMPUS)， 核型自动分析系统(Cytoktype V6.22)，CO2细胞培养箱(Thermo)，姬姆萨染液(Baso)。

1.2  外周血淋巴细胞培养

男性正常志愿者，无辐射接触史，采静脉血 3 ml，肝素抗凝。无菌培养瓶，每瓶加RPM1640完全培养基(20%小牛血清，植物血凝素PHA 100 μg/ml) 5 ml，加外周血5滴，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.3  辐照

细胞培养液加入外周血1 h后，置于加速器下，4MV的X射线，垂直照射，球靶距100 cm，剂量率3.8 Gy/min，分别给予0.5、1、2、4 Gy的辐射剂量。

1.4  制片及G显带

细胞培养72 h后，加秋水仙素(0.8 μg/ml) 0.2 ml，2 h后收获细胞。

以2 000 r/min的速度离心15 min；弃上清，加入37 ℃的KCl (0.075 mol/L)5 ml，放置37 ℃培养箱内，低渗处理25 min；加1 ml固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)预固定片刻，离心；弃上清，加新配置固定液8 ml，吹打均匀后，固定30 min，离心；弃上清，再固定24 h。

弃上清至0.5～1 ml，加入反固定液(甲醇∶冰醋酸=1∶3)2～3滴，制成细胞悬液；取冰载玻片，气干法制片；将滴好的玻片放入60 ℃烤箱中隔夜干燥 (15 h)。将烤过的玻片置37 ℃水浴中的胰酶(0.06%)消化 2 min。将消化过的玻片立即放入新配置的1∶7吉姆萨染料中4 min后取出，清水漂洗，自然干燥后，镜下读片分析。

1.5  染色体分析

先用低倍镜按从上到下、从左到右的“之”字形方向按顺序观察，发现合适的中期细胞后，再转到高倍镜下进行核型分析。应用染色体核型自动分析系统进行核型自动配对排列后，由两名有经验的工作者进行修正、确认。

观察100个染色体分散良好、形态清晰的细胞核型，统计各类畸变染色体数目(双着丝粒、缺失、易位、环状染色体、染色体片段)，分别计算其畸变百分率(畸变染色体数目/观察细胞的总数×100%)。

1.6  统计学方法

计算不同辐射剂量的各型染色体畸变百分率，绘制散点图并拟合趋势线。

 

2  结  果

经辐照后外周血淋巴细胞的染色体出现双着丝粒、缺失、易位、环状染色体、染色体片段等畸变，(见图1、2)。各类型畸变率与辐照剂量关系的统计及其拟合情况见表1及图3。

 

3  讨  论

电离辐射可以导致细胞染色体发生多种类型的畸变，其中应用非显带技术进行双着丝粒和着丝环的分析是目前最常用的生物剂量评估方法[1-2]，作者尝试应用G显带技术分析辐射导致的染色体畸变的量-效关系。

非显带技术使用Giemsa染料使染色体均匀着色，可以根据各染色体的特征(大小、着丝粒位置)大致识别，很难准确分辨，因此在辐射剂量分析中只能应用双着丝粒和着丝环进行判断。G显带技术则通过应用胰蛋白酶溶液处理染色体标本，使染色体染色后在普通显微镜下呈现出深浅相间的带纹，通过深带的“浓”“淡”以及距离着丝粒的远近，可以准确的识别每一条染色体[3]。不仅可以对双着丝粒、着丝环进行准确的判断，而且可以对辐射导致的染色体缺失、易位进行比较准确的分析。如图1中的标记“2”染色体为双着丝粒染色体，通过条带分析可以识别出为14和15号染色体的联会；图2中的标记“1”染色体为1号染色体长臂缺失；标记“2”染色体为易位的1号和14号染色体。

近50年来，随着非显带技术的出现，发现辐射导致染色体双着丝粒畸变在一定范围内和辐射剂量正相关，染色体双着丝粒畸变成功的应用于生物剂量估算；而G显带技术的应用，可以更进一步的丰富研究内容，包括缺失、易位、片段等染色体畸变。在本研究中，通过对双着丝粒畸变、缺失畸变、易位畸变、片段畸变的散点图拟合趋势线分析，辐射剂量(0.5~4 Gy)和各畸变类型的畸变百分率均呈线性正相关。

高分辨显带技术、染色体涂染技术可以较G显带提供更丰富更准确的染色体结构图像。一套单倍体染色体的G显带条纹数约320条，通过高分辨显带技术可以获得550～850的带纹，即在原有的带纹上分出更多更细的亚带，有助于发现更多、更细微的染色体结构异常。染色体涂染技术则是将荧光原位杂交和染色体探针制备技术相结合而建立的分析诊断技术，用不同的荧光涂染整条染色体或者染色体特异性区段，从而更准确的完成染色体结构异常的分析[4-5]。本研究希望可以通过G显带分析在辐射中的应用，为高分辨显带技术、染色体涂染技术在辐射中的应用提供借鉴。

 

参考文献

[1]  李秀芹，于瑞敏，赵进沛，等.  染色体畸变研究方法及其在生物剂量估算中的应用[J].  中国辐射卫生，2006，l5 (1)：116-117.

[2]  Livingston GK， Falk RB， Schmid E.  Effect of occupational radiation exposures on chromosome aberration rates in former plutonium workers[J]. Radiat Res，2006，166 (1)：89-97.

[3]  陈  竺，傅继粱，陆振虞.  医学遗传学[M].  人民卫生出版社，2008：45-81.

[4]  Lynn H， Rainer KS， Mariel V， et al. Radiation-induced chromosome aberrations: insights gained from biophysical modeling[J].  Bio Essays，2002，24 (8)：714-723.

[5]  Nakano M， Kodama Y， Ohtaki K， et al. Detection of stable chromosome aberrations by FISH in A-bomb survivors: comparison with previous solid Giemsa staining data on the same 230 individuals[J]. Int J Radiat Biol，2001，77 (9)：971-977.

 

收稿日期： 2010-12-12；修订日期：2011-01-12

基金项目： 2010年陕西省卫生厅科研基金项目(2010D10)

作者简介： 施常备(1971-  )，男，西安人，博士生，研究方向：辐射生物学。

*Correspondence to: WANG Xiang，E-mail：WX62@163.com

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