基于三色流式细胞术的小鼠外周血微核试验方法的建立

 

周长慧1/王    征1/王庆利2/杨琛懋1/常    艳1,﹡

(1. 上海医药工业研究院国家上海新药安全评价研究中心，上海    201203；2. 国家食品药品监督管理局药品审评中心，北京    100038)

 

Three-color  labeling  method  for  flow  cytometric  measurement  of  micronucleus  in  mouse  peripheral  blood

 

ZHOU  Chang-hui1,  WANG  Zheng1,  WANG  Qing-li2,  YANG  Chen-mao1,  CHANG  Yan1,*

(1.  National  Shanghai  Center  for  New  Drug  Safety  Evaluation  &  Research,  Shanghai  Institute  of  Pharmaceutical  Industry,  Shanghai  201203;  2.  Center  for  Drug  Evaluation,  State  Food  and  Drug  Administration,  Beijing  100038,  China)

 

【摘要】  目的：  为克服传统显微镜检微核(micronucleus，MN)方法耗时、费力、主观等缺点，建立基于CD71、CD61荧光抗体和碘化丙啶(cyclophosphamidr，PI)的三色流式细胞术(flow  cytometry，FCM)研究小鼠外周血微核的自动化检测方法。 方法:  经口单次给予小鼠0、20、40和80  mg/kg环磷酰胺(CP)，于不同时间点收集外周血；另一批小鼠给予CP  40  mg/(kg·d)经口灌胃，连续染毒5  d，分别于给药前和每次给药后24   h收集外周血。采用-80 ℃甲醇固定血细胞，CD71、CD61荧光抗体、RNA酶和PI孵育血细胞，以疟原虫感染的红细胞作为生物标准物调校FCM后，对CP诱导的小鼠外周血中含MN的CD71+网织红细胞(reticulocytes，RET)进行检测。 结果:  单次染毒后48  h  MN-RET达峰值，且MN-RET呈现明显的剂量依赖性增加(r  =0.984  9,  P<0.01)；重复染毒5  d，FCM监测的 MN-RET染毒2  d后达到稳态水平。FCM检测的MN-RET峰值和稳态水平与常规显微镜观察的骨髓微核率有良好的相关性(r=0.921  2, P<0.01)。 结论:  FCM小鼠外周血微核法稳定可靠，可以作为常规显微镜小鼠骨髓阅片法的替代方法，用于小鼠体内微核试验。

【关键词】   CD71；  流式细胞仪； 网织红细胞； 微核； 环磷酰胺

   中图分类号： R99       文献标识码：  A       文章编号：  1004-616X(2011)02-0128-06       doi: 10.3969/j.issn.1004-616x.2011.02.011

 

【ABSTRACT】  OBJECTIVE:  To  overcome  time-consuming,  laborious,  subjective  and  other  shortcomings  of  the  traditional  microscopic  examination  method  of  micronuclei  (MN),  we  established  flow  cytometry  (FCM)  method  for  automatic  analysis  of  micronuclei  in  mouse  peripheral  blood  stained  with  anti-CD71-FITC,  anti-CD61-PE  and  PI.  METHOD:  Mice  received  a  single  oral  dose  of  0,  20,  40,  80  mg/kg  cyclophosphamide  and  blood  was  sampled  at  different  times  before  and  after  treatment.  Additional  mice  were  orally  treated  with  40  mg/kg  cyclophosphamide  for  5  consecutive  days  and  blood  was  collected  before  and  after  treatment  at  24  h  interval.  Blood  cells  were  fixed  in  -80  ℃  methanol  and  stained  with  anti-CD71-FITC,  anti-CD61-PE,  RNase  and  PI.  After  instrument  was  calibrated  with  malaria-infected  erythrocytes  as  a  biological  standard,  the  frequencies  of  micronucleated  CD71-positive  reticulocytes  were  measured  by  FCM.  RESULTS:  The  highest  frequency  of  MN-RET  was  observed  at  48  h  after  single  treatment,  and  MN-RET  showed  dose-dependent  accumulation  (r=0.9849,  P<0.01).  These  data  acquired  by  FCM  demonstrated  that  the  steady-state  of  MN-RET  was  attained  approximately  24  h  after  the  second  administration  with  5  consecutive  days  treatment.  Parallel  analysis  of  micronucleus  induction  in  peripheral  blood  by  FCM  and  bone  marrow  using  traditional  microscopy-based  method  showed  concordant  results  (r=0.9212,  P<0.01).  CONCLUSION:  The  three-color  flow  cytometric  assessment  of  MN-RET  in  mouse  peripheral  blood  can  be  considered  as  an  acceptable  substitute  to  microscopy-based  analysis  in  mouse  bone  marrow  micronucleus  test  in  vivo.

【KEY   WORDS】  CD71;  flow  cytometry;  reticulocyte;  micronucleus;  cyclophosphamide

 

微核试验检测终点明确、结果重复性好，且易于开展，是自20世纪70年代创建至今最常用的评估化合物是否具有遗传毒性诱导潜能的体内评价系统。由于外界损伤因素导致细胞染色体丢失或断裂，从而在胞浆中形成1个或数个小核，即微核(micronucleus，  MN)[1]。因此，微核试验不仅可以检测作用于DNA的染色体断裂剂还可以检测作用于纺锤装置的非整倍体诱导剂。目前常规采用啮齿类动物(主要是小鼠)的骨髓或外周血涂片，显微镜阅片计数骨髓嗜多染红细胞(polychromatic  erythrocytes，  PCE)或外周血网织红细胞(reticulocytes，  RET)中的MN。该法操作简便，易于开展，然而需要技术员制片、染色和丰富的阅片经验；此外，MN发生率很低，小鼠MN-PCE或MN-  RET百分率的基础值约为0.25%(即约2  000  PCE或2  000  RET中有5个MN)[2]，故阅片耗时、枯燥，结果易受主观因素影响，且统计能力有限，因而迫切需要建立一些高通量、客观、灵敏和自动化的替代方法。MN具有边缘清晰、特异染色的特征，尤其适用于流式细胞仪(flow  cytometry，  FCM)技术进行自动化计数[3]。早期FCM检测MN的探索研究多采用核酸特异性的染料区别DNA  和RNA，如Hoechst  33342、噻唑橙[4]或吖啶橙[5]等。CD71荧光抗体和碘化丙啶(PI)双色荧光标记技术的应用，增加了FCM检测MN的准确性和可重复性[6-8]。本研究采用MicroFlow?    推荐的单激光三色FCM法，以环磷酰胺(cyclophosphamide，CP)为诱变剂，分析单次和重复给药小鼠外周血网织红细胞中的微核诱导作用，并与常规显微镜骨髓阅片结果进行对比，以验证该法在不同的给药方案下的灵敏度和准确性。

 

1    材料与方法

1.1    主要材料和仪器

成熟雄性ICR小鼠30只，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司，生产许可证号SCXKE(沪)2008-0016；CP购自Sigma公司(CAS号6055-19-2)；胎牛血清(FBS)购自Biowest公司(生产批号S05312S1550)；离心机购自Heraeus  Instruments(型号Labofuge  400R)；显微镜购自Olympus  Corporation(型号CX31)；小鼠  MicroFlow?  PLUS微核分析试剂盒(购自Litron  Laboratories，  Rochester，NY)；流式细胞仪购自BD公司(型号FACS CaliburTM  Flow  Cytometry  342975)。

1.2    给药和取样

1.2.1    单次给药     20只ICR小鼠随机分成4组，即溶剂对照组(生理盐水)、低、中、高3个CP剂量组，依次为CP  20、40、80  mg/kg，每组5只，单次灌胃给药(10  ml/kg)， 分别于给药前(0  h)和给药后12、24、48、72  h眼眶静脉丛取血(60～120  μl)，加至350  μl肝素钠抗凝剂(500  USP)的小管中，轻轻混匀，置冰浴上冷藏，24  h内固定。20只ICR小鼠按上述分组同时给药处理，在给药后24  h取股骨骨髓，用1  ml  FBS稀释重悬骨髓细胞。

1.2.2    重复给药     10只ICR小鼠随机分成2组，即阴性对照组(生理盐水)和给药组(CP  40  mg/kg)，每组5只，灌胃给药(10  ml/kg)，每天灌胃1次，连续5  d。分别于给药前(0  d)和每次给药后24  h(即1  d、2  d、3d  、4  d、5  d)眼眶静脉丛取血(60~120 μl )，加入350  μl肝素钠抗凝剂(500  USP)的小管中，轻轻混匀，置冰浴上冷藏，24  h内固定。每组动物末次取血后取股骨骨髓，用1  ml  FBS稀释重悬骨髓细胞。

1.3    样品处理

每次血样采集前1  d，在15  ml离心管中加入2  ml甲醇，做好标记，置-75～-85  ℃的低温冰箱中预冷。血样采集后，吸取180  μl混匀的外周血细胞悬液至对应的甲醇离心管中，涡旋震荡3～5  s，固定3  d。3  d后从低温冰箱中逐一取出离心管，迅速加入12  ml的冰冷Hank’s平衡盐溶液(HBSS)，混匀，置冰浴中。离心沉淀血细胞(300  g，10  min，4  ℃)，将细胞重悬于约50  μl的HBSS中，4  ℃保存，准备染色。按每个样品100  μl  1%  FBS磷酸缓冲液、1  μl  RNA酶、1  μl  anti-CD71-FITC抗体配制成标记溶液Ⅰ；按每个样品100  μl标记溶液Ⅰ和0.5  μl的anti-CD61-PE抗体配制成标记溶液Ⅱ。将20  μl疟原虫感染的生物标准品加入80  μl标记溶液Ⅰ的流式管中，然后分别将20  μl疟原虫感染的生物标准品、CD71-阴性样品、试剂盒中提供的阴性和阳性对照品以及本试验样品加入相应的80  μl标记溶液Ⅱ的流式管中，混匀后在4  ℃孵育30  min，再于37  ℃孵育15  min，以充分降解RNA，最后于室温孵育15  min后，置4  ℃保存待FCM分析。

另将骨髓细胞离心(100  g，5  min)沉淀，用约0.5  ml的FBS重悬细胞，取100～200  μl该细胞悬液涂片，每只动物涂片2张。按常规方法进行甲醇固定和Giemsa染色。

1.4    FCM检测和显微镜骨髓阅片

采用488  nm氩离子激光谱的FCM及CellQuest  3.3软件对血样品进行分析。每个样品进行FCM分析前，加入当日新鲜配制预冷的PI染色溶液2  ml，于4  ℃孵育约5  min。  anti-CD71-FITC、anti-CD61-PE和PI  3种荧光信号分别通过FL1、FL2和FL3通道检测。每份血样分析20  000个CD71+的RET，同时排除CD61+的细胞(即血小板细胞)的干扰。通过RET百分率体现骨髓细胞毒性，MN-RET百分率反映药物的遗传毒性。

另在显微镜油镜下选取细胞重叠少、分布良好、染色清晰的区域，每只动物共计数  2  000个PCE，记录其中的含微核细胞数。同时计数约500个红细胞，记录其中的PCE数。其中PCE百分率体现骨髓细胞毒性，MN-PCE百分率反映药物的遗传毒性。

1.5    数据统计方法

数据以-x ±s表示，采用SAS  9.1.3软件进行统计学分析。平均数的比较用单侧   t  检验，并进行线性相关分析，α=0.05为检验水准。   

 

2    结    果

2.1    生物标准物调校FCM

用CD71-阴性样品和疟原虫感染的红细胞作为生物标准物调校电压和荧光补偿，使与PI相关的FL3通道上出现稳定的单个疟原虫感染的红细胞峰值(信号通道22±2)，见图1，同时较明显地区分成熟红细胞(NCE)、网织红细胞(RET)、含微核的成熟红细胞(MN-NCE)和含微核的网织红细胞(MN-RET)4种细胞群，见图2。在分析本实验样品前，用该生物标准物确定的分析区域、象限和稳定的流速(HI，每秒约6  000个细胞)分析试剂盒中提供的阴性对照品(批号MN0708)和阳性对照品(批号MP0708)，结果阴性对照品RET百分率和MN-RET百分率分别为2.32%和0.29%，阳性对照品RET百分率、MN-RET百分率分别为1.18%和2.89%， 均在试剂盒提供的合理范围内(见表1)。

2.2    小鼠外周血中MN出现至消失的时效关系

单次给药后，结果显示不同的给药剂量小鼠外周血中MN-RET百分率均在给药后48  h达峰值，48  h后MN-RET百分率急剧降低，72  h的低、中剂量组MN-RET百分率接近或者恢复至0  h自发突变基值水平，72  h高剂量组MN-RET百分率降至与其24  h  MN-RET百分率水平相当(见图3a)。中、高剂量组小鼠外周血中RET百分率呈现时间依赖性降低，显示在这2个剂量水平下骨髓毒性较大(见图3b)。外周血中MN-RET百分率的峰值(给药后48  h)与常规显微镜观察的骨髓中MN-PCE百分率(给药后24  h)的结果进行对比，具有良好的相关性(r  =  0.988  5)，见图4。

2.3    CP诱导的小鼠外周血MN剂量依赖性关系

给药前0  h检测的小鼠外周血中MN-RET百分率和RET百分率为背景基值，分别为0.32%±0.06%(范围值0.21%～0.45%，n=30)，2.44%±0.46%(范围值1.67%～ 3.76%， n=30)。自0  h至单次给药后48  h，各剂量组MN-RET百分率呈现剂量依赖性增加，以24  h  (r  = 0.9830， P<0.01) 和48  h  (r=0.984  9， P<0.01)  更为明显，而至72  h，各剂量组MN-RET百分率呈现剂量依赖性降低  (r  = 0.950  5，  P<0.01)(见图3a)。自给药后24  h起，各剂量组RET百分率随剂量升高而逐渐降低，由此显示24  h后，CP各个剂量对小鼠骨髓均有抑制作用，且呈现剂量依赖关系(见图3b)。

2.4    FCM监测重复给予CP后小鼠外周血中的稳态水平

结果显示CP组连续给药2  d后MN-RET百分率明显升高，达到给药前的约10倍水平，给药第2天至第5天FCM检测到的MN-RET百分率呈缓慢的升高趋势(见图5a)，末次给予CP后24  h骨髓中的MN-RET百分率(2.15%±0.44%)约是阴性对照组(0.25%±0.06%)的10倍。溶剂对照组连续给予5  d生理盐水MN-RET百分率始终保持稳定的水平，与末次取血后骨髓中MN-PCE百分率水平相当。溶剂对照组RET百分率呈现逐渐上升趋势，而CP组RET百分率与对照组相比明显下降(见图5b)； 骨髓阅片中CP组PCE占红细胞的比例与溶剂对照组相比也有所降低，由此显示40  mg/kg的CP影响了红细胞的生成，对骨髓造血功能有一定的抑制作用。

 

 

 

3    讨    论

将FCM引入遗传毒性微核试验中，其自动化检测技术检测速度快，结果客观可靠，基本可以满足高通量检测的要求，已作为常规显微镜计数的替代方法的研究方向。本试验的目的是采用单次和重复给药两种试验方案，使用MicroFlow?  PLUS试剂盒评估单激光FCM在检测小鼠外周血中MN-RET  的能力。本试验方法的主要特点在于：

采用小鼠外周血红细胞而非常规的骨髓红细胞作为靶细胞进行研究，其优势在于小鼠是极少数脾脏不会消除外周血中微核的实验动物，采用特定的技术评价小鼠外周血中微核水平能较准确地反映小鼠骨髓中的微核水平(见图4)。单次给药或重复给药两种方案均在给药前和给药后不同时间点取血，对小鼠外周血中RET百分率有影响，溶剂对照组RET百分率逐渐增加(见图3b、图5b)。这可能因为在同一个实验动物多次取血刺激了骨髓红细胞的生成和RET的成熟[9]，但是并不会影响该法检测MN-RET百分率的灵敏度，同时大大减少动物用量，而且动物给药前后自身对照，既符合实验动物福利3R原则(减少、替代和优化)，又增加了实验效率；此外，采用重复给药方案使外周血中MN达到稳态水平，且每次只需微量血样，故不需要独立的试验来评价化合物的体内遗传毒性作用，可整合入一般毒理研究试验中(如反复给药毒性试验或药代毒代试验)[10]。

采用FCM自动化检测工具，FCM检测单次给药的峰值和重复给药的稳态水平与常规显微镜观察的骨髓微核率有良好的相关性(r  =  0.921  2，  P<0.01)。然而它与常规方法相比表现出更大的优势：首先，在数小时内FCM可以分析30个动物血样，而在相同的时间内常规显微镜阅片只能完成5张左右；此外，使用FCM每个血样至少分析20  000个RET，是常规骨髓阅片的10倍，大大增加了MN检测的准确性和统计能力，也可基本满足目前分子生物学大量候选化合物的高通量毒性筛选要求；除速度和通量提高以外，FCM亦能得出MN大小和分布的资料，即PI相关的荧光数值的大小(如DNA含量)，这也有利于MN形成机制的研究，区别分析该遗传毒性化合物是DNA断裂剂还是非整倍体诱导剂[11]。

FCM染色方法除使用CD71荧光抗体和PI分别标记RET和MN外，增加了抗血小板试剂(即CD61荧光抗体)，主要作用是排除血小板对MN检测的影响，因为取血操作不理想，如使血小板激活，血小板是造成MN假阳性的一个重要因素[12]；本试验技术系统的另一个关键因素是利用伯氏疟原虫感染的红细胞这个生物标准物，调节FCM光电倍增管电压和荧光补偿，作为每次FCM调校的质量控制工具。国际上不同实验室合作研究的结果也显示，用这一方法调校FCM，不同实验室和同一实验室不同时间的MN检测结果变异很小，增加了该系统的稳定性和可重复性[11，  13]。

试验系统中FCM检测的48  h外周血MN-RET百分率峰值水平与24  h骨髓阅片MN-PCE百分率结果的相关性较好，但是RET百分率和PCE百分率反映的骨髓细胞毒性结果无很好的相关性，其原因可能有：首先，本试验中两种计数方法使用的染料不同，FCM采用CD71荧光抗体，可以特异性地标记外周血中未成熟红细胞(即RET)，而相比之下Giemsa染色特异性差，它的局限性可能是造成PCE百分率不稳定的重要原因；其次，两种方法计数标准不同，FCM需要计数20  000个RET，而显微镜观察只需要计数大约200个PCE，样本量小也制约了PCE百分率结果的可信度；再次，动物本身的质量和个体差异问题，因为动物成熟水平关系到骨髓造血系统是否旺盛，即成熟红细胞和非成熟红细胞的比例基础值存在差异。

总之，通过本研究我们成功建立了基于CD71、CD61荧光抗体和PI染色的三色单激光流式细胞仪微核检测方法，与常规显微镜计数方法相比结果更快速、更有效、更客观，提示该技术在药物毒性筛选中可能会有很大的应用前景。FCM作为显微镜观察MN的一种替代方法已经被美国食品药品管理局(U.S.  Food  and  Drug  Administration，FDA) [14]和经济合作发展组织(Organization  for  Economic  Cooperation  and  Development， OECD)  [15]接受认可，但是目前尚未推出标准化试验方案。在我国仍需要进一步的验证研究，促进该技术在我国药物研发早期筛选和申报管理体系中早日得到推广应用。

 

参考文献

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[15] Organization  for  Economic  Cooperation  and  Development.  Guideline  for  the  testing  of  chemicals：  mammalian  erythrocyte  micronucleus  test[S].  Paris：  OECD，  1997：474.

 

收稿日期：  2010-11-04；  修订日期：2010-11-29

基金项目：  上海科委专业技术服务能力建设基金资助项目(09DZ2290900)

作者简介：  周长慧(1985-    )，女，硕士研究生，研究方向：遗传毒理和生殖毒理。E-mail:  yalu521@sina.com

*Correspondence  to： CHANG  Yan，  E-mail:  ychang@ncdser. com

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