电离辐射对胃癌细胞增殖和周期的影响

 

高  玲1,2/李峰生3/陈肖华2/刘青杰1,*

(1． 中国疾病预防控制中心辐射防护与核医学安全所，北京  100088； 2． 军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京  100850； 3． 第二炮兵总医院，北京  100088)

 

Effects of ionizing radiation  on the proliferation and cell cycle of gastric adenocarcinoma cells

 

GAO Ling1,2, LI Feng-sheng3, CHEN Xiao-hua2, LIU Qing-jie1,*

(1. National Institute for Radiological Protection，China CDC, Beijing 100088; 2.  Institution of Radiate Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850; 3. General Hospital of Second Artillery, Beijing 100088,  China)

 

【摘要】 目的： 研究电离辐射对体外胃腺癌细胞增殖、凋亡及周期的影响。方法： 60Coγ 射线单次照射胃腺癌BGC-823细胞，照射剂量分别为0、2、4 Gy，利用MTT和克隆形成率实验检测各剂量组BGC-823的增殖能力；同时利用Annexin-V/PI双染法检测各剂量组BGC-823细胞的凋亡；用PI单染测定各剂量组BGC-823的细胞周期。结果： 与0 Gy组相比，2、4 Gy 60Coγ 射线照射可显著抑制胃腺癌BGC-823细胞的增殖(P＜0.05)，诱导BGC-823细胞在照射后依次出现S期和G2/M期阻滞。4 Gy 60Coγ射线照射后48 h，凋亡细胞比例显著高于对照组(P＜0.05)。结论：60Coγ射线照射可抑制胃腺癌细胞BGC-823增殖、诱导胃癌细胞出现周期阻滞和细胞凋亡。

【关键词】 胃癌； 辐射； 增殖； 凋亡； 细胞周期

   中图分类号： R811.5，Q691.5   文献标识码： A   文章编号： 1004-616X(2011)02-0119-04   doi: 10.3969/j.issn.1004-616x.2011.02.009

 

【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To study the effects of ionizing radiation on the proliferation, apoptosis and cell cycle of gastric adenocarcinoma cells in vitro. METHODS: After gastric adenocarcinoma BGC-823 cells were irradiated by 60Coγ-rays with a single dose of 0, 2 or 4 Gy,  the proliferation ability of BGC-823 cells in every dose group was evaluated by MTT and cloning efficiency assay.  Apoptosis and cell cycle were further investigated by flow cytometry with Annexin-V/PI double staining and PI staining, respectively.  RESULTS: Compared with the 0 Gy group,  proliferation of gastric adenocarcinoma cells was inhibited significantly after doses of 2 and 4 Gy γ-rays irradiation (P<0.05). Furthermore, the  cells were arrested in S then G2/M phases after γ-rays irradiation of 2 and 4 Gy. Finally, compared with 0 Gy group, the percentage of apoptotic cells in 4 Gy dose group increased significantly 48 h after irradiation (P<0.05).  CONCLUSION: Radiation treatment of gastric adenocarcinoma BGC-823 cells with 60Coγ-rays could inhibit cell proliferation, induce cell cycle arrest and promote  apoptosis.

【KEY  WORDS】 gastric adenocarcinoma; radiation; proliferation; apoptosis; cell cycle

 

胃癌是世界范围内高发的恶性肿瘤之一，胃癌中以胃腺癌最为常见。早期胃腺癌患者一般以手术治疗为主，其5年生存率可达90%[1]。然而，70%的胃腺癌患者在确诊时已处于中晚期，需要进行辅助治疗。放化疗是临床上最常用的肿瘤辅助治疗措施，但由于胃腺癌细胞对放射不敏感、对射线具有抗性，因此对胃腺癌的辅助放射治疗还具有一些争议[2-3]。为此，本研究观察了胃腺癌BGC-823细胞在受到60Co γ射线照射后，细胞增殖、凋亡及细胞周期的变化，在体外探讨胃腺癌细胞的放射敏感性及胃腺癌放射治疗的细胞生物学机制。

 

1  材料与方法

1.1  试剂

特级胎牛血清(FCS)购自元亨圣马公司；DMEM培养基购自美国Gibco公司；Annexin-V细胞凋亡检测试剂盒购自中国凯基公司。

1.2  细胞培养

人胃腺癌BGC-823细胞购自协和细胞库，用含有10%灭活胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素的DMEM培养液培养。

1.3   60Coγ 射线照射细胞

利用军事医学科学院钴源单次照射细胞，剂量率214.47 cGy/min，钴源距细胞生长面4 m，均匀照射野的大小为50 cm ×50 cm，照射剂量分别为0、2和4 Gy。

1.4  MTT实验

照射后立刻消化BGC-823细胞，计数并调整细胞浓度至2×104/m1后将细胞分别接种至96孔板，每孔100μl细胞悬液，常规条件培养。分别于照射后0、1、2、3 d时每孔加入MTT (5 mg/m1)10 μl，继续培养4 h，弃培养液，加入二甲亚砜(DMSO)150 μl，振荡摇匀，使结晶完全溶解，490 nm波长酶标仪测各孔吸光度值，每个剂量点每次测量设5个复孔。以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制生长曲线。

1.5  克隆形成率实验

常规消化经0、2 和4 Gy剂量γ射线照射的BGC-823细胞，计数。取300个细胞接种于含5 m1培养液的60 mm培养皿中，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀。将培养皿移入培养箱，在37 ℃、5％CO2环境下静置培养7 d后终止培养。用预温的D-Hank’s液洗涤2遍后，甲醇固定20 min，冲洗晾干后用吉姆萨染液染色，解剖显微镜下计数克隆数，按下式计算存活分数(survival fraction)：

克隆形成率(％)=(克隆数/接种细胞数)×100％

存活分数 (％)=(处理细胞克隆形成率/对照细胞克隆形成率)×100％

1.6   Annexin-V/PI双染法检测细胞凋亡

将BGC-823细胞以每孔5×106个铺于6孔板内，常规培养24 h后利用钴源分别进行0、2、4 Gy照射。照射后24和48 h收集细胞，加入1 ml预冷PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，接着以1 000 r/min，4 ℃离心10 min，弃上清后将细胞重悬于200 μl Binding Buffer，加入10 μl Annexin Ⅴ-FITC和5 μl PI，轻轻混匀，避光室温反应15 min，最后加入300 μl Binding Buffer，1 h内流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.7  细胞周期测定

0、2和4 Gy照射后不同时间的BGC-823细胞经胰蛋白酶溶液消化后，用PBS溶液洗涤3次。用0.3 ml含5%FCS的PBS悬浮细胞，再加入0.7 ml无水乙醇，混匀后置于－20 ℃固定过夜。PBS离心洗涤2次，加入200 μl(1 mg/ml)RNase A，37 ℃水浴30 min；加入50 μg/ml的PI染液400 μl，20 min后上流式细胞仪(Beckman) 分析。

1.8  统计学方法

应用SPSS 12.0统计软件进行数据处理，照射组与对照组之间的比较采用t 检验，以α = 0.05为检验水准。

 

2  结  果

2.1  60Coγ 射线照射对BGC-823细胞增殖的抑制

MTT实验检测60Coγ射线照射对BGC-823细胞增殖影响的结果见图1。图1显示2 Gy和4 Gy的γ射线照射后，BGC-823细胞增殖受到显著抑制，其中2 Gy照射组第2天和第3天的抑制率分别为13.43%和16.86%  (与0 Gy组比较，P＜0.05)；4 Gy照射组第1、2、3天的抑制率分别为14.09%、19.97%和31.50%(与0 Gy组比较，P＜0.05)。 

为了进一步确认不同剂量照射对胃癌细胞存活的影响，我们利用克隆形成率试验对MTT的检测结果进行了验证。结果如图2所示， 2和4 Gy 60Coγ射线照射后，BGC-823细胞的存活分数分别为16.77%和7.78%，显著低于0 Gy对照组(P ＜0.05)。

2.2  60Coγ 射线照射对BGC-823细胞凋亡的影响

利用Annexin-V/PI双染法检测60Coγ 射线照射对BGC-823细胞凋亡的影响，结果如图3所示。2 Gy照射组BGC-823细胞凋亡率与对照组间的差异无统计学意义(P＞0.01)，4 Gy照射组在照射后48 h时，细胞凋亡率较0 Gy对照组增加27.4%(P＞0.05)。 　　

 2.3  不同剂量照射后BGC-823细胞的周期改变

流式细胞术检测不同剂量60Coγ射线照射对BGC-823细胞周期影响的结果如图4所示，照射后4 h细胞开始出现S期阻滞，2 Gy和4 Gy组S期细胞比例与0 Gy组比较分别增加7.77%和10.78%；照后8 h时S期阻滞最为显著，2 Gy和4 Gy组S期细胞比例与0 Gy组比较分别增加11.51%和13.60%；照后16 h时S期细胞比例基本恢复至正常水平。G2/M期阻滞结果如图5所示，照后8 h细胞开始出现G2/M期阻滞，2 Gy和4 Gy组G2/M期细胞比例较0 Gy组分别增加14.28%和18.37%；照后20 h G2/M期细胞比例达到最大值，2 Gy和4 Gy组G2/M期细胞比例较0 Gy组分别增加17.91%和39.71%；此后开始降低，照射后16 h时逐渐达到正常水平。

 

3  讨  论

放射治疗是恶性肿瘤治疗的重要手段，约60％～70％的肿瘤患者在病程的不同时期需要接受放射治疗。放疗是通过射线的直接或间接作用来抑制肿瘤细胞的增殖、促进其凋亡，从而起到杀伤肿瘤细胞的作用。目前放疗对于多种癌症均具有较好的临床效果[4-6]。本研究结果表明，2和4 Gy 60Coγ射线照射可显著抑制胃腺癌细胞的增殖，可诱导BGC-823细胞S期和G2/M期阻滞。同时4 Gy 60Coγ 射线照射还可以显著地诱导BGC-823细胞凋亡。电离辐射产生的这些细胞生物学效应是放疗治疗胃腺癌的基础。

绝大多数肿瘤细胞在受到致死剂量的电离辐射后会经历“有限的分裂后死亡”，这时它们的DNA已经因为电离辐射而发生双链断裂，但还能勉强分裂成功，断裂的DNA在分裂过程中多次复制，使这些损伤在子代细胞中积累，最后导致死亡。因此这些细胞将表现为增殖抑制，细胞的增殖能力非常有限，一般不会超过4～5个分裂周期。培养时，这些细胞产生的克隆很小，细胞数不会超过50[7]。几乎所有的肿瘤细胞在受到照射后都会发生增殖抑制，但只有敏感的细胞才会出现细胞凋亡[8-10]。本研究的结果证实，虽然2 Gy 60Coγ 射线照射可以引起BGC-823细胞出现增殖抑制，但该剂量并不足以使其出现凋亡，只有辐射剂量增加时，才会诱导BGC-823细胞出现细胞凋亡。已知细胞周期阻滞是肿瘤细胞对电离辐射做出的一种适应性反应[11-13]。BGC-823细胞在受到60Coγ 射线照射后，首先出现S期阻滞，之后出现G2/M期阻滞。S期为DNA合成期，S期阻滞意味着DNA合成速度的减慢，以便赢得时间充分修复辐射导致的DNA损伤；对于未能修复的细胞，接下来的G2/M期阻滞，将能对断裂的DNA双链以重组方式继续进行修复，确保细胞染色体组的完整性和稳定性，减少突变的发生。

 

参考文献

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[13] Jorgensen TJ. Enhancing radiosensitivity： targeting the DNA repair pathways[J]. Cancer Biol Ther， 2009，8 (8)：665-670.

 

收稿日期： 2010-10-20；修订日期：2010-11-20

基金项目： 国家自然科学基金(30870749，30570551)

作者简介： 高  玲(1978-  )，女，新疆人，助理研究员，研究方向：放射医学。E-mail：gaolinglinggao@yahoo.com.cn

﹡Correspondence to:  LIU Qing-jie, E-mail：qjliu@nirp.cn

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