p-Stat3、VEGF-C和MMP-2在非小细胞肺癌中的表达及其与淋巴结转移的关系

 

王凤云/张艳桥*/罗   明/武   云/李   鹏/李志伟/孙   伟

(包头医学院第三附属医院肿瘤科，内蒙古 包头  014030)

 

The expressions of p-Stat3 ,   VEGF-C and  MMP-2 in non-small cell lung cancer and their relationship  with lymph node metastasis

 

WANG Feng-yun, ZHANG Yan-qiao*, LUO Ming, WU Yun, LI Peng, LI Zhi-wei, SUN Wei

(The Affliliated Third Hospital of Baotou Medical College, Baotou 014030, Inner Mongolia,  China)

 

【摘要】 目的： 检测非小细胞肺癌组织中磷酸化信号转导和转录激活子-3 (p-Stat3)、血管内皮生长因子C(VEGF-C)和基质金属蛋白酶2( MMP-2)的表达情况，探讨p-Stat3与VEGF-C、MMP-2之间，以及这三者与临床病理指标之间的相关性。 方法: 采用免疫组织化学SP法，检测53例非小细胞肺癌组织和10例正常肺组织中p-Stat3、VEGF-C和MMP-2的表达情况, 并对p-Stat3、VEGF-C和MMP-2的表达情况进行相关性分析。 结果: 在53例非小细胞肺癌病例中，p-Stat3、VEGF-C和MMP-2的阳性表达率分别为45.2%(24/53)、77.3%(41/53)和58.4%(31/53)。其中，p-Stat3的表达在腺癌中最显著，阳性表达率为75%(9/12)，且在低分化肺癌组织中的表达明显高于高分化肺癌组织( P＜0.01)，在有淋巴结转移的肺癌组织中高于无淋巴结转移的肺癌组织( P＜0.05)，而阳性表达率与患者的年龄、性别和肿瘤的大小无明显相关 ( P＞0.05)。VEGF-C和MMP-2在有淋巴结转移的非小细胞肺癌组织中的阳性表达率高于无淋巴结转移的肺癌组织( P＜0.05)，且VEGF-C、MMP-2的表达与p-Stat3的表达呈正相关(依次为r = 0.427和0.345,P均＜0.05)。 结论: 在非小细胞肺癌组织中，p-Stat3、VEGF-C和MMP-2表达均上调，高表达的p-Stat3与肺癌的发生、发展及淋巴结转移密切相关，其机制可能与VEGF-C和MMP-2有关。

【关键词】  非小细胞肺癌； p-Stat3； VEGF-C； MMP-2； 免疫组织化学； 淋巴结

   中图分类号： R734.2      文献标识码： A      文章编号： 1004-616X(2011)02-0107-04      doi: 10.3969/j.issn.1004-616x.2011.02.006

 

 

【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To examine the expressions of p-Stat3, VEGF-C and MMP-2 and to study their relationship. METHODS: P-Stat3, VEGF-C and MMP-2 proteins were detected in formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens from 53 non-small cell lung cancer tissues and 10 normal lung tissues by SP immunohistochemical method. The levels of their expression and their relationship with p-Stat3, VEGF-C and MMP-2 were analyzed. RESULTS: In 53 non-small cell lung cancers, p-Stat3, VEGF-C and MMP-2 was expressed in 45.2%(24/53), 77.3%(41/53) and 58.4%(31/53),  respectively. p-Stat3 expression was more pronounced in adenocarcinoma at 75%(9/12).  p-Stat3 expression was much higher in the poorly differentiated than the well differentiated tissues (P ＜0.01).  p-Stat3, VEGF-C and MMP-2 expressions were much higher in the non-small cell lung cancers with lymph node metastasis than those without(P＜0.05). There was no significant correlation with the size of tumor, age and sex of the patients(P＞0.05). There was also positive correlation between the expressions of p-Stat3 and VEGF-C, MMP-2 in non-small cell lung cancer(P＜0.05). CONCLUSION: p-Stat3, VEGF-C and MMP-2 were upregulated in non-small cell lung cancer. Over-expression of p-Stat3 in the non-small cell lung cancer development and metastases may be related to VEGF-C and MMP-2.

【KEY  WORDS】 non-small cell lung cancer; p-Stat3; VEGF-C; MMP-2; immunohistochemical method; lymph node

 

肺癌占我国城市中恶性肿瘤的首位，而在农村占第3位，且发病率也存在明显增高的趋势，是严重威胁人民健康和生命的疾病[1]。在肺癌中，非小细胞肺癌占80%以上。而非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的复发和转移是影响肺癌病人术后5年生存率的重要因素之一, 其中淋巴结转移已成为评估NSCLC患者预后的主要指标之一。因此，研究NSCLC 可能的转移复发机制，对NSCLC病人的预后判断及治疗选择有重要意义。

 

1  材料与方法

1.1  临床资料

收集哈尔滨医科大学附属肿瘤医院2005年10月至2008年10月手术后经病理学检查证实为NSCLC患者的石蜡包埋组织块53例，患者术前均未接受任何化疗及其它治疗，其中男44例，女9例，年龄42~76岁(平均53岁)；鳞癌36例，腺癌12例，腺鳞癌5例；伴淋巴结转移者25例，无淋巴结转移者28例。53例NSCLC按TNM分期，I期28例，II期20例，III期5例。选10例距离肿块边界5 cm的正常肺组织为正常对照组织。

1.2  实验方法

1.2.1  主要试剂  兔抗人Phospho-Stat3 单克隆抗体(购自Cell Signaling公司)，兔抗人VEGF-C多克隆抗体(使用时稀释为1∶50)、山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体 PV-6001(均购自北京中杉金桥公司)，鼠抗人MMP-2免疫组化单克隆抗体(使用时稀释为1∶20/1∶40)、即用型免疫组织化学超敏SP试剂盒KIT-9710(均购自福州迈新生物技术开发有限公司)。

1.2.2  标本及处理  将每例石蜡标本切片，厚度为4 μm，常规于60 ℃温箱烘烤2~3 h，捞片后置于 60 ℃烤箱干燥 24 h，室温保存备用。

1.2.3  免疫组织化学SP法  53例NSCLC和10例正常肺组织均行免疫组织化学染色。样本的石蜡切片常规脱蜡、水化、置入抗原修复液中修复5 min后，采用Evnison二步法行免疫组化染色,再用DAB显色、复染，检测磷酸化信号转导和转录激活子-3(p-Stat3)、血管内皮生长因子C(VEGF-C)和基质金属蛋白酶2( MMP-2) 的表达。在25例伴有淋巴结转移的肺癌中，选取14例分别进行原发灶和转移灶的p-Stat3检测。

1.2.4  细胞阳性表达的判断标准  p-Stat3细胞阳性标准：细胞形态完整，结构清晰，棕黄色至棕褐色颗粒定位于细胞核。MMP-2和VEGF-C细胞阳性标准：形态完整，结构清晰，棕色或棕黄色细颗粒特异性定位于胞浆和胞膜上。每张切片选择3个区域，分别在400倍视野下连续计数20个瘤细胞，以阳性细胞数<25%记为阴性(-)，阳性细胞数≥25%～75%为阳性(+)，>75%为强阳性(++)。

1.3  统计学方法

采用SPSS13.0软件包，对计数资料采用χ 2检验分析，两因素间的相关性采用Spearman等级相关检验分析，α = 0.05为检验水准。

 

2  结  果

2.1  p-Stat3，VEGF-C和MMP-2的表达情况

10例正常肺组织，p-Stat3的表达均呈阴性(图1)； 53例NSCLC病例中，p-Stat3的阳性表达率为45.2% (24/53)(图2)，其表达与病理类型有关(P＜0.05) ，在腺癌中表达最显著，75%(9/12)呈阳性；p-Stat3的表达与分化程度亦有关，在低分化肺癌组织中的表达明显高于高分化肺癌组织(P＜0.05)(图3、4)；在有淋巴结转移的肺癌组织中的表达高于无淋巴结转移的肺癌组织(图5、6)，而其阳性表达率与患者的年龄、性别和肿瘤的大小无明显相关关系(P＞0.05)。而VEGF-C和MMP-2的表达阳性率分别为77.3%(41/53)和58.4%(31/53) (图7和图10)。VEGF-C和MMP-2在有淋巴结转移的肺癌组织中的表达高于无淋巴结转移者(P＜0.05)(图8、9、11、12)。p-Stat3、VEGF-C和MMP-2在非小细胞肺癌中的具体表达情况见表1。

2.2  在有淋巴结转移的NSCLC原发灶和其淋巴结转移灶中p-Stat3的表达情况

在选取的14例有淋巴结转移的NSCLC淋巴结转移灶组织中，p-Stat3的表达高于原发灶(P＜0.05), 见表2。

2.3  p-Stat3与VEGF-C、MMP-2表达的相关性

 p-Stat3与VEGF、MMP-2的表达呈显著正相关，其中p-Stat3与VEGF-C的相关系数r = 0.427(P＜0.05), p-Stat3与MMP-2的相关系数  r = 0.345 (P＜0.05), 见表3。

 

3  讨  论

肺癌是全世界最常见的恶性肿瘤，淋巴结转移和远处转移是肺癌病人重要的死亡原因。肺癌一旦发生远处转移，标志着疾病已进入晚期。现有的医疗手段如放疗、化疗仅仅是一个姑息治疗的手段，很难使患者得到更长期的生存。因此，研究肺癌转移的可能机制，对肺癌的早期诊断、治疗选择及预后均有重要意义。

Stat3是转录信号转导子与激活子家族(signal transducers and activators of transcription , Stats) 的重要成员，广泛表达于不同类型的细胞和组织中，受大量细胞因子、生长因子和癌基因调节，其生物学功能广泛，在调节细胞增殖、存活和分化方面起着关键作用。研究表明[2]，p-Stat3与恶性肿瘤的发生、发展及转移密切相关。Xie等[2]在黑色素瘤脑转移模型中发现，p-Stat3可调节VEGF和MMP-2的表达。

本研究结果显示，正常肺组织中未见p-Stat3的表达，而在NSCLC组织中p-Stat3表达呈阳性，尤其是在腺癌中表达较高，且在低分化NSCLC组织中的表达明显高于高分化肺癌组织，差异具有统计学意义(P<0.01)，但与患者的年龄、性别和肿瘤的大小无明显关系。表明p-Stat3的表达不但与NSCLC的发生有关，而且与病理类型有关，并且p-Stat3表达的高低与肺癌分化程度相关，提示p-Stat3的表达可作为判断NSCLC患者预后的参考指标之一。

研究证实[4] p-Stat3在有淋巴结转移的前列腺癌组织中的表达高于无淋巴结转移者。本实验亦得出相同结论：p-Stat3在有淋巴结转移的NSCLC组织中的表达高于无淋巴结转移的肺癌组织。我们还进一步检测了NSCLC淋巴结转移灶组织中p-Stat3的表达情况，发现淋巴结转移灶中p-Stat3 的表达高于原发灶，差异有统计学意义(P<0.05)。由此推测， p-Stat3表达的高低可能与NSCLC淋巴结转移有关。

近年来，Stat3成为肿瘤治疗探讨的新靶点，将靶向性地阻断Stat3信号的物质与传统的药物结合使用, 可使抗肿瘤治疗更为有效。体外研究中，成功地将Stat3作为靶点抑制肿瘤发生、发展和转移的结果表明，靶向Stat3将有可能进入临床。总之，癌基因Stat3与多种恶性肿瘤发生、发展密切相关，其与肿瘤治疗的研究已经取得明显进展，深入研究Stat3信号传导通路有可能为肿瘤基因治疗提供新的理论与实践基础。将针对Stat3途径的分子治疗与传统的放疗、化疗结合用于临床，可能是今后的研究方向之一。

VEGF-C属于血管内皮生长因子/血小板源生长因子(VEGF/PDGF)家族的成员，是迄今为止发现的重要淋巴管生成因子。本实验显示，VEGF-C在有淋巴结转移的NSCLC组织中的表达明显高于无淋巴结转移的NSCLC组织，差异有统计学意义(P<0.01)。这一结果表明，VEGF-C的表达高低与局部淋巴结转移有关,这可能是由于过度表达的VEGF-C与VEGFR-3结合后，诱导了淋巴管内皮细胞的增殖和新生淋巴管的形成[5]。因此，VEGF-C的表达情况，一定程度上反映了肺癌患者淋巴结转移情况，可以作为肺癌淋巴结转移的预测性指标进行临床应用。

MMP-2是MMPs家族中的一个成员，具有降解基底膜中骨架成份IV胶原的能力，在肿瘤浸润与转移中扮演重要的角色。本实验发现，MMP-2在有淋巴结转移的肺癌组织中的表达高于无淋巴结转移的肺癌组织，差异具有统计学意义(P<0.05)。由此推断，MMP-2可能对肺癌侵袭和淋巴结转移有促进作用。

本实验研究对p-Stat3与VEGF-C和MMP-2在肺癌中表达的相关性进行统计分析，结果表明，p-Stat3与VEGF-C和MMP-2的表达呈正相关关系。由此推断，p-Stat3与肺癌的发生、发展及淋巴结转移密切相关，其促进侵袭与淋巴结转移的机制可能与VEGF-C和 MMP-2有关，三者之间的进一步关系尚需分子生物学检测和信号传导通路来证实。

 

参考文献

[1]  周际昌. 实用肿瘤内科学[M]. 2版. 北京: 人民卫生出版社, 2003：3.

[2]  Bowman T, Garcia R, Turkson J. STATs in oncogenesis[J]. Oncogene, 2000, 19 (21)：2474-2488.

[3]  Tong-xin X, Feng-Ju H, Kenneth DA, et al. Activation of Stat3 in human melanoma promotes brain metastasis[J]. Cancer Res, 2006, 66：3188-3196.

[4]  Abdulghani J, Gu L, Dagvadorj A, et al. Stat3 promotes metastatic progression of prostate cancer[J]. Am J pathol, 2008, 172 (6)： 1717-1728.

[5]  Shimizu K, Kubo H, Yamaguchi K, et al. Suppression of VEGFR-3 signaling inhibits lymph node metastasis in gastric cancer[J]. Cancer Sci，2004， 95 (4)：328-333.

 

收稿日期： 2010-10-09； 修订日期：2010-11-17

基金项目： 黑龙江省教育厅科学技术研究项目(11541224)，黑龙江省自然科学基金重点项目(ZD200804-02)

作者简介： 王凤云(1970-  )，女，内蒙古包头人，硕士，副主任医师，研究方向：肿瘤治疗。Tel：0472-5182536; E-mail: wfy2826@163.com

*Correspondence to： ZHANG Yan-qiao，E-mail：yanqiaozhang@126.com

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