海藻色素糖蛋白对小鼠H22肝癌细胞增殖与凋亡的影响

 

李  帅/钟进义*/杨  青/全香花

(青岛大学医学院营养研究所，山东  青岛  266021)

 

Effects of seaweed pigment glycoprotein on the proliferation and apoptosis of mice hepatocarcinoma 22 cells

 

LI Shuai, ZHONG Jin-yi*, YANG Qing, QUAN Xiang-hua

(Institute of Nutrition, Medical Collage of Qingdao University, Qingdao 266021, Shandong, China)

 

【摘要】 目的： 研究麒麟菜海藻色素糖蛋白(seaweed pigment glycoprotein, SPG)对小鼠H22肝癌细胞增殖与凋亡的影响。方法：将不同浓度SPG与小鼠H22肝癌细胞共同培养，用MTT法测定癌细胞增殖活性。建立H22移植瘤小鼠肝癌模型，随机分为SPG高、中、低剂量组，对照组及环磷酰胺组。实验组小鼠每天分别给予不同剂量(100、50、10  mg/kg)的SPG灌胃，连续10 d，对照组同法给予等量生理盐水，环磷酰胺组小鼠腹腔注射20 mg/kg环磷酰胺，隔日一次。各组小鼠均于末次给受试物后24 h处死，取肿瘤组织用免疫组化法检测各组Bcl-2和Bax蛋白表达。结果：SPG高剂量组瘤细胞增殖活性(0.545±0.002)明显高于对照组(0.404±0.008)(P<0.05)；SPG高剂量组Bcl-2和Bax蛋白阳性表达率分别为16.78%和38.1%，对照组分别为65.16%和4.68%，两组间的差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：SPG具有抑制小鼠H22肝癌细胞增殖、促进其凋亡的作用。

【关键词】 海藻色素糖蛋白； H22肝癌细胞； 增殖； 凋亡

  中图分类号： R730.5    文献标识码： A    文章编号： 1004-616X(2011)02-0103-04    doi: 10.3969/j.issn.1004-616x.2011.02.005

 

【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To study the effects of SPG on the proliferation and apoptosis of mice hepatocarcinoma 22 cells.  METHODS: Different concentrations of SPG were cultured with hepatocarcinoma 22(H22) cells, MTT assay was used to analyze the cell proliferation. The H22-bearing mice were randomly divided into SPG high, medium, low dose groups (100, 50, 10 mg/kg), tumor control group and the cyclophosphamide group.  Mice in exprimental groups were given daily by gavage with different doses of SPG for 10 days, the control group was given nomal saline and mice  in cycliphosphamide group were given 20 mg/kg cyclophosphamide by injection every other day. All the mice were sacrificed 24 hours later after the last administration,  the levels of the Bcl-2 and Bax protein expression were measured by immunohistochemistry method.  RESULTS: The proliferation activity of tumor cells in high-dose SPG group(0.545±0.002) was significantly higher than tumor control group (0.404±0.008)(P<0.05). The expression levels of Bcl-2 and Bax protein in high-dose SPG group were 16.78% and 38.1%, respectively, and those of the tumor control group were 65.16% and 4.68%, respectively. The differences between two groups were significant (P＜0.05). CONCLUSION: SPG could inhibit proliferation and induce  apoptosis of H22 hepatocarcinoma cells effectively.

【KEY  WORDS】 seaweed pigment glycoprotein; H22 hepatocarcinoma cells; proliferation; apoptosis

 

海藻色素糖蛋白(seaweed pigment glycoprotein，SPG) 是从海洋红藻麒麟菜中提取的一类藻胆蛋白与硫酸多糖的天然结合物。已有研究表明，海藻中藻胆蛋白与硫酸多糖均具有抗肿瘤、抗突变等生物学功效[1-3]，但对于红藻中糖蛋白类物质抗肿瘤的研究报道极少，本实验以海洋红藻麒麟菜为原料，提取麒麟菜中SPG，以H22肝癌小鼠模型为实验对象研究SPG的抗肿瘤作用。

 

1  材料与方法

1.1  实验材料及主要仪器

SPG由本实验室制备，用乙醇浸提法从新鲜干燥麒麟菜中提取，经紫外分光光度法测定其纯度>90%。H22肝癌细胞株由山东省实验动物中心提供。山东鲁抗医药实验中心提供健康昆明种小鼠，动物合格证号：SCXK鲁20080002。体质量18～20 g，于本实验室内适应性喂养1周后用于实验。环磷酰胺,购自江苏恒瑞医药股份有限公司；RPMI-1640培养基、胎牛血清、四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自Gibco公司； Bcl-2、Bax多克隆抗体、SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。瑞典产Rosys Anthos2010型自动酶标仪；日本产Olympus XDS-1B型倒置显微镜。

1.2  细胞实验

取处于对数生长期的H22肝癌细胞，用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基调整瘤细胞密度至5×105/ml，接种于96孔培养板，每孔100 μl。分设加入SPG高、中、低浓度(100、50、10 mg /L)组和加入等量双蒸水的对照组，每组设3个平行样。37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h，用自动酶标仪于490 nm处测定吸光度D(490)值。各组细胞增殖活性用D(490) 值表示。并按下式计算各组的细胞增殖抑制率：

细胞增殖抑制率＝[空白对照组D(490)值－实验组D(490)值]/ 空白对照组D(490)值×100%

1.3  动物实验

 1.3.1  瘤细胞接种及动物分组   无菌条件下抽取H22肝癌细胞腹腔内接种6 d的小鼠腹水，用生理盐水稀释瘤细胞浓度调整至1×107 /ml，于受试小鼠右腋皮下接种0.2  ml。将已接种H22肝癌细胞的小鼠随机分为对照组，SPG高、中、低(100、50、10 mg /kg)3个浓度实验组、对照组及环磷酰胺组(阳性对照)，每组10只。SPG实验组小鼠每天分别经口灌胃给予不同浓度的SPG；环磷酰胺组小鼠腹腔注射20 mg/kg环磷酰胺，隔日1次；对照组小鼠给予等量生理盐水。实验连续10 d。实验期间动物自由进食和饮水。于末次给药后24 h小鼠脱臼处死，取瘤组织备检。

1.3.2  肿瘤生长抑制率的测定  在小鼠接种瘤细胞10 d后处死，立即分离瘤体，用电子天平称取瘤质量，并按下式计算各组的肿瘤生长抑制率：

肿瘤生长抑制率＝(肿瘤对照组平均瘤质量－实验组平均瘤质量)/ 对照组平均瘤质量×100%

1.3.3  Bcl-2和Bax蛋白表达水平的检测  将瘤组织经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片。采用免疫组化方法(SABC)，按检测试剂盒说明操作，检测瘤组织中Bcl-2、Bax蛋白表达水平。经SABC免疫组化方法，DAB显色，脱水，透明和封片处理。Bcl-2蛋白主要表达于细胞浆，呈黄色或棕黄色颗粒的细胞为Bcl-2蛋白表达阳性细胞。Bax蛋白为胞浆表达，细胞浆中见黄色或棕黄色颗粒的细胞为Bax蛋白表达阳性细胞。在显微镜下观察Bcl-2和Bax蛋白的表达水平，每张切片随机观察5个高倍视野(×400)，记录每个视野的阳性细胞数和观察的细胞总数。按下式计算阳性表达率：

阳性表达率=(阳性细胞数/计数细胞总数)×100%

1.4   统计学方法 数据

数据以-x ±s表示，采用SPSS17.0统计软件处理，用单因素方差分析及χ2检验，以α=0.05为检验水准。

 

2  结  果

2.1  肿瘤细胞增殖活性

结果见表1。对照组细胞增殖活性为(0.545±0.002)明显高于SPG 100 mg / L剂量组肿瘤细胞增殖活性(0.404±0.008)(P <0.05)；且SPG 100 mg / L剂量组的细胞抑制率较50、10 mg/ L剂量组均显著升高(P < 0.05)，显示SPG对肿瘤细胞增殖活性的抑制作用具有剂量-效应的趋势。

 

 

2.2  肿瘤生长抑制率

结果见表2。肿瘤对照组平均瘤重为(0.55±0.23)g明显高于SPG 100 mg/kg剂量组瘤重(0.31±0.05)g (P< 0.05)；SPG 100 mg/kg组肿瘤生长抑制率为43.64%，显著高于10 mg/kg剂量组肿瘤生长抑制率(9.10%) (P<0.05)。

2.3  Bcl-2和Bax蛋白的表达

本实验肿瘤对照组Bcl-2蛋白阳性细胞数多，染色呈棕黄色，呈高表达，见图1A。高剂量SPG组的阳性细胞数少且染色浅多呈淡黄色，呈低表达，见图1B。各组Bcl-2及Bax阳性表达率见表3。对照组Bcl-2阳性表达率(65.16%)明显高于SPG 100 mg/kg剂量组(16.78%)(P <0.05)。对照组Bax蛋白阳性细胞数少，染色浅，呈弱表达(见图2A)，阳性表达率为4.68%。而SPG 100 mg/ kg剂量组的阳性细胞数多且染色深，呈强阳性表达(见图2B)，阳性表达率为38.1%，二者间的差异具有统计学意义(P＜0.05)。

 

3  讨  论

海洋中的藻类及软体动物等生物的体内含有丰富的巯基多糖，具有清除自由基、 增强免疫力及抗基因突变、抗肿瘤等多种生理及药理功能[4-5]。本实验结果也表明，用不同浓度海洋红藻麒麟菜中硫酸多糖与藻胆蛋白的天然结合物SPG灌胃荷H22肝癌小鼠，可降低肿瘤组织中Bcl-2蛋白的表达，提高Bax蛋白的表达水平。提示SPG具有一定的抗肿瘤作用。

麒麟菜(Eucheuma)是一种热带海洋红藻类植物,主要产于我国海南及东南亚等沿海地区[6]。目前，对于麒麟菜活性成分的研究仅限于硫酸多糖和藻胆蛋白，而从藻类中提取藻胆蛋白的工艺复杂、性质不稳定且得率低而限制了其大规模开发应用。糖蛋白是一类由糖类和蛋白质或多肽以共价键连接而形成的天然结合蛋白[7]，是一类十分重要的多糖复合物。近年来从各种生物体中提取的天然糖蛋白表现出显著的药理学效应[8-9]，但是对于红藻中糖蛋白抗肿瘤的研究报道极少。本实验将麒麟菜中藻胆蛋白与硫酸多糖共同提取，得到了二者处于天然结合状态的复合物海藻色素糖蛋白(SPG)，并采用体内外实验相结合的方法观察了SPG对小鼠H22肝癌细胞增殖与凋亡的影响。

细胞增殖活性是反映细胞生命力强弱的重要指标，当细胞生长受到抑制，首先表现的是增殖活性的降低。MTT法是目前国内外测定细胞增殖活性的常用方法，其吸光度值与细胞的代谢活性成正比[10]。本实验结果显示，同肿瘤对照组比较，SPG 100 mg/kg组的肿瘤细胞增殖活性水平显著降低，肿瘤细胞增殖抑制率达25.87%，其差异具有统计学意义(P＜0.05)；而10 mg/kg的SPG对肿瘤细胞的抑制作用较小，表明100 mg/kg的SPG对于小鼠H22肝癌细胞的增殖具有一定的抑制作用。

Bcl-2是一种重要的抗凋亡蛋白，对细胞凋亡担负着重要的调控作用，可以抑制多种机制引起的细胞凋亡[11]。当细胞受到损伤、增殖活性受到抑制或发生细胞凋亡时，Bcl-2蛋白的表达水平降低。Bax在调控肿瘤细胞凋亡上起着重要作用，是凋亡促进因子，Bax高表达可促进多种细胞发生自发凋亡[12]。本次实验结果显示，100 mg/kg SPG组小鼠瘤组织的Bcl-2蛋白呈低水平表达，而Bax蛋白呈高表达；肿瘤对照组则高表达Bcl-2蛋白而低表达Bax蛋白，且两组间差异具有统计学意义；提示SPG具有促进小鼠H22肝癌细胞凋亡的作用。

综上，本次实验结果表明，SPG能够抑制H22肝癌细胞增殖，降低肝癌组织中Bcl-2蛋白表达水平，提高Bax蛋白表达水平，促进H22细胞凋亡，对小鼠H22肝癌细胞具有一定的抑制作用。

 

参考文献

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[7]  刘兴华，赵浩如.天然糖蛋白的提取、分离与纯化[J].药学进展，2006，30(12)：542-547.

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[11] Testa U，Ricci O. Deregulation of apoptosis in acute myeloid leukemia[ J ].  Haematol- ogica, 2007， 92 (1)： 81-94.

[12] Sharpe JC，Amoultt D，Youle RJ.Control of mitochondrial permeability by Bcl-2 family members[J]．Biochim Biophys Acta，2004，1644 (2/3)：107-113．

 

收稿日期： 2010-11-08； 修订日期：2010-12-14

作者简介： 李   帅(1985-  )，女，满族，硕士研究生，研究方向：基础毒理学。

*Correspondence to: ZHONG Jin-yi,  E-mail: Zhongjy03@ yahoo.com.cn

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