黏蛋白1基因磁转染树突状细胞诱导细胞毒性T细胞抗膀胱肿瘤免疫效应的研究

 

孙   璇/夏昕晖/廖育芬/张东方/王固新/罗  刚

(深圳市福田人民医院泌尿外科，广东 深圳，518033）

 

Induction of specific CTL against bladder cancer by MUC1  gene-modified dendritic cells transfected with dextran coated magnetic iron oxide nanoparticles

 

SUN Xuan，XIA Xin-hui，LIAO Yu-fen，ZHANG Dong-fang，WANG Gu-xin，LUO Gang

(Department of Urology, Futian People's Hospital, Shenzhen 518033, Guangdong,  China）

 

【摘要】 目的：  探讨黏蛋白1(mucins 1, MUC1)基因磁转染体外人树突状细胞(dendritic cell, DC）的可行性，观察其诱导的特异性抗MUC1膀胱癌CTL的免疫效应。 方法： 以葡聚糖磁性纳米颗粒(DMN）作为载体，在多聚赖氨酸(PLL）的辅助下，通过静电作用结合MUC1基因的真核表达载体pEGFP-C1-MUC1，在钕－铁－硼稀土强磁块的磁场作用下转染DC ，荧光显微镜下观察及流式细胞术检测转染效率，并用RT-PCR法检测转基因DC中MUC1基因的表达；再将转染MUC1基因的DC与自体T细胞共培养，并分别用乳酸脱氢酶释放法检测所致敏的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte，CTL）对MUC1特异性抗膀胱癌(膀胱肿瘤BIU87细胞系）的杀伤活性，用透射电镜观察CTL诱导靶细胞凋亡情况；ELISA法测定MUC1基因修饰后的DC刺激自体T细胞分泌IFN－γ的能力。 结果： pEGFP-C1-MUC1转染效率为10％左右，荧光显微镜下可观察到明显绿色荧光蛋白的表达，RT-PCR法可检测到MUC1条带，转染MUC1基因的DC与自体T细胞混合培养后能诱导出MUC1特异性的CTL，对BIU87细胞的杀伤实验表明T-DC-MUC1 的杀伤活性显著高于对照组T-DC-pEGFP-C1和T-DC诱导的CTL(P均＜0.05)；在透射电镜下也可观察到部分BIU87膀胱肿瘤细胞出现了细胞核核仁消失，染色质浓集于核膜周围等早期凋亡表现；基因修饰后的DC能刺激自体T细胞分泌高水平的IFN－γ，明显高于未转染的DC(P<0.05）。 结论： 葡聚糖磁性纳米颗粒在固定磁场的作用下成功将MUC1基因转入DC，并可有效诱导出特异性抗MUC1膀胱癌的细胞毒性T细胞。

【关键词】 MUC1基因；膀胱癌； 人树突状细胞； 免疫效应； 葡聚糖磁性纳米颗粒； 转染

   中图分类号： R730.51     文献标识码： A     文章编号： 1004-616X(2011)02-0098-05     doi: 10.3969/j.issn.1004-616x.2011.02.004

 

【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To examine the ability of plasmid DNA encoding the human mucins 1(MUC1) to elicit antigen-specific CTL responses by gene transfer mediated by dextran coated magnetic iron oxide nanoparticles (DMN） as gene carrier in vitro. METHODS： Dextran coated magnetic iron oxide nanoparticles (DMN） modified with Poly-L-Lysine (PLL） as gene carrier transfected plasmid pEGFP-C1-MUC1 as the reporter gene into human dendritic cells (HDC） in the magnetic field using Nd-Fe-B permanent magnet in vitro, and the rate of plasmid pEGFP-C1-MUC1  transfection into human dendritic cells were evaluated under fluorescence microscope，using RT-PCR and flow cytometer 24 h later.  The transfected and nontransfected DC were then cocultured with autologous T cells , and with targeted bladder cancer cells (BIU87） seven days later.  The cytotoxic activity or apoptosis of induced CTL to BIU87 was detected with LDH release assay or transmission electron microscope respectively. The IFN－γ secretion of the CTL was measured by ELISA assay. RESULTS： DMN acted as a vector in the magnetic field to transfect reporter gene pEGFP-C1-MUC1 into HDC.  GFP was successfully expressed 24 h after transfection，and the rate of plasmid pEGFP-C1-MUC1 transfection was 10%. MUC1 expression was also detected as mRNA level in pEGFP-C1-MUC1 transfected DC. The transfected DC (DC-MUC1） successfully induced CTL with autologous T cells cocultured for seven days.  The cytotoxic activity of induced CTL to BIU87 by T-DC-MUC1 was obviously higher than that by T-DC-pEGFP-C1 or T-DC. Transmission electron microscope showed apoptosis in the earlier period of CTL to BIU87 induction, for instance，disappearance of the nucleus、chromatin enriched around nuclear membrane, etc. There was significant difference in the ability of IFN－γ secretion between the transfected and nontransfected DC groups. CONCLUSION： Super-paramagnetic dextran coated magnetic iron oxide nanoparticles (DMN） as a vector could transfect plasmid pEGFP-C1-MUC1 into HDC MUC1 protein could enhance the ability of DC to stimulate autologous T cells proliferation and induce most potent cytotoxicity of CTL to bladder cancer cells(BIU87）.

【KEY WORDS】 MUC1 gene； bladder cancer； human dendritic cells immunological effect； dextran coated magnetic iron oxide nanoparticles； human dendritic cells； gene carrier .

 

随着对肿瘤相关抗原的深入研究，人们发现黏蛋白 (mucins 1,MUC1)在肿瘤的发生、发展以及对调节机体的免疫应答中具有重要的作用。MUC1 在肿瘤发生时可发生量和质的改变, 出现新的抗原表位，并且是最先与机体免疫系统接触的细胞表面分子之一，可以非MHC 限制性和MHC 限制性方式活化细胞毒性T淋巴细胞 (cytotoxic lymphocyte，CTL)，这些活化的CTL可杀伤表达MUC1 的肿瘤细胞。因此，MUC1 成为了肿瘤主动特异性免疫治疗的理想靶分子[1]。本研究中我们将已经构建的MUC1基因真核表达质粒转染人外周血来源诱导扩增的树突状细胞 (dendritic cell，DC)，观察其诱导的CTL抗膀胱肿瘤细胞的免疫效应，为MUC1基因治疗膀胱肿瘤提供理论依据。

 

1  材料与方法

1.1  材料和试剂

携带有绿色荧光蛋白的MUC1基因真核表达质粒 (pEGFP-MUC1)由英国癌症研究所惠赠，DMEM高糖培养基、胎牛血清均购自武汉凌飞公司；人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)、人白细胞介素4 (IL-4)、人肿瘤坏死因子 (TNF-α)均购自达科为公司；质粒大提试剂盒、RNA 提取试剂盒、LDH试剂盒、INF-γ的ELISA试剂盒均购自Gibco公司。膀胱肿瘤细胞系BIU87取自本实验室传代培养的细胞。葡聚糖磁性纳米颗粒DMN (120~130 nm，PH=7.42，Fe3O4 =532~1 735 μg/ml) 以及钕-铁-硼稀土强磁块均由武汉理工大学研究所提供。

1.2  质粒的制备及纯化

按质粒大提试剂盒说明书的程序操作，大量制备及纯化MUC1基因真核表达质粒 (pEGFP-C1-MUC1)，采用分光光度计测定其D (260)及D (280)的吸光度值，计算质粒的含量及纯度。其 D (260)/ D (280)＝1.935。将其稀释成浓度为1 g/L，置－20 ℃保存备用。

1.3  DC体外分离和培养

参考文献[2]的方法取健康人的新鲜外周血100 ml，密度梯度离心 (800 r/min，20 min)分离收集外周血的单个核细胞 ，调节细胞浓度至106 / ml。然后置于6孔板中，每孔2 ml，37 ℃贴壁2 h后，将悬浮细胞吸出置于含有DMEM高糖完全培养基的培养瓶中备用，再将贴壁的DC用胎牛血清洗脱，加入含有GM-CSF(100 μg/L、IL-4 20 μg/L)的DMEM高糖完全培养基后，置于37 ℃、5％的CO2培养箱中培养。每隔1 d半量换液1次，第3次换液后改为每隔1 d半量换液1次，共培养7 d后送透射电镜检测DC的转化成熟情况。

1.4  磁转染DC

收集培养了7 d的DC转入24孔板，用无血清无双抗的DMEM高糖培养基重悬培养，调整细胞浓度为每孔105个，置37 ℃、5％的CO2培养箱中孵育过夜，参照孙璇等[3] DMN载体在外加磁场作用下的转染方法，将 DMN、PLL和质粒pEGFP-MUC1按1∶1质量比混匀后，在4 ℃放置1 h以上备用。然后每孔加入混合液100 μl，轻摇混匀，并将钕-铁-硼稀土强磁块放置于24孔板下形成外加磁场，12 h后添加含有GM-CSF ( 100 μg/L）和IL-4 ( 20μg/L)的DMEM高糖培养基继续培养24 h，并以转染空载体的DC作为对照。

1.5  DC中MUC1表达的检测

DC细胞转染24 h后在倒置荧光显微镜下观察转染效果，并收获实验组DC细胞，制成细胞悬液，用10%甲醛固定后上流式细胞仪分析细胞内荧光强度。

RT -PCR法检测转染DC中MUC1的表达，根据已知MUC1的cDNA序列设计引物：上游引物 5' -CGGAA TTCTATGACACCGGGCACCCAGTC-3'，下游引物5' -CGGGATCCCTACAAGTTGGCAGAAGTGGCTC -3' ，用于扩增MUC1。

采用RNA提取试剂盒提取转染24 h的DC总RNA，取2 μg总RNA作逆转录, 使用M-MLV 逆转录酶, 按照使用说明操作，其反应体系25 μl： RNA 10 μl, 随机引物1 μl, RNA酶抑制剂1 μl, 5×buffer 5μl, dNTP混合物1 μl, DEPC处理水6 μl, AMV 1 μl。逆转录程序：4 ℃预变性3 min后，按94 ℃  35 s、72 ℃  60 s、55 ℃  50 s进行32个循环，55 ℃延伸5～10  min 。经逆转录获得cDNA 。

PCR扩增目的基因 (MUC1)及电泳鉴定： 50 μl反应体系中, 上、下游引物各2 μl, 5×buffer 5μl, dNTP混合液1μl, cDNA 2 μl, Taq酶1μl, DEPC处理水37 μl, 94 ℃  2 min, 93 ℃  45 s, 56 ℃  70 s , 72 ℃  5 min, 30个循环, PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳鉴定, 以转染空载体的DC作为对照。

1.6  CTL的诱导及杀伤活性检测

将步骤1.3中培养后分离的细胞利用尼龙毛柱法[4]洗涤过滤，将洗涤下来的细胞收集培养即为T细胞。将T细胞分别与已转染基因的DC (DC-MUC1)、已转染空载体的DC (DC- pEGFP-C1)以及单纯的DC 按10∶1的比例，细胞浓度106/ml，混合孵育7 d诱导CTL，分别标记为T-DC-MUC1、T-DC- pEGFP-C1与T-DC。

特异性CTL杀伤检测：以膀胱肿瘤细胞系BIU87作为特异性靶细胞，按效靶比为10∶1、5∶1、2.5∶1混合培养6 h后，采用乳酸脱氢酶 (lactate dehydrogenase，LDH)释放试验测定CTL特异性杀伤效应 (按LDH试剂盒说明进行)。并收集部分靶细胞送透射电镜观察。

1.7  CTL培养上清中的INF-γ测定

将诱导出的CTL (T-DC-MUC1、T-DC- pEGFP-C1与T-DC)分别再培养5 d后，1 500 r/min离心5 min，采用ELISA法测定上清液中的γ干扰素 (interferon-gamma，INF-γ)。

1.8  统计学方法

采用SPSS l0.0软件处理数据， T-DC-MUC1、T-DC-pEGFP-C1与T-DC杀伤膀胱肿瘤BIU87细胞所得的LDH释放值用方差分析，以α = 0.05为检验水准。

 

2  结  果

2.1  DC的形态学观察

DC培养至第7 天贴壁细胞聚集成均匀散在分布的小细胞团，部分细胞已经开始悬浮生长。透射电镜显示DC已经呈现明显的树突状形态 (图1)。

 

 

 

 

2.2  检测pEGFP-C1-MUC1表达结果

用倒置荧光显微镜下对转染24 h后的DC进行定时观察，在外加磁场作用下样品孔中能够观察到明显的绿色荧光点，并且绿色荧光均位于DC细胞膜的表面(图2)，而在转染空载体对照组的DC，虽也可见绿色荧光表达，但大多数位于胞浆内，阴性对照孔则完全未观察到，结果表明转染组pEGFP-C1-MUC1基因成功转染入DC并有效表达于细胞表面，流式细胞仪显示转染效率约为10％。

 

2.3  RT-PCR法检测转染DC中MUC1的表达

转染MUC1真核表达载体的DC扩增后可见明显条带，转染空载体的DC以及阴性对照DC均无条带出现。见图3。

2.4  CTL杀伤活性检测结果

在转染了MUC1基因的DC的刺激下，能够明显诱导出对MUC1特异性的CTL。对特异性靶细胞BIU87膀胱肿瘤细胞而言，CTL (T-DC-MUC1)具有明显的杀伤活性，与非特异性杀伤的T-DC- pEGFP-C1和T-DC对照组相比较，其差异均具有统计学意义 (P < 0.05)。而且随着效靶比的升高，CTL杀伤活性逐渐增强。而T-DC- pEGFP-C1和T-DC对照组相比则差异不大。见表1。

通过对靶细胞的透射电镜的观察，我们还发现部分BIU87膀胱肿瘤细胞出现了细胞核核仁消失，染色质浓集于核膜周围等早期凋亡表现。见图4。

2.5  CTL上清中的INF-γ测定结果

INF-γ是由成熟DC激活T细胞分泌所致，实验表明在没有DC刺激条件下T细胞分泌INF-γ的量很少；但是加入成熟DC后分泌量便有所提高；两者间并无显著差异 (P > 0.05)。而在转染了MUC1基因的DC的刺激下，T细胞分泌INF-γ的能力明显增强，而在转染空载体组的DC作用下，INF-γ分泌量也会明显增加，与单纯DC组和T细胞组比较具有统计学意义 (P < 0.05)。见图5。

 

3  讨  论

黏蛋白是一种Ⅰ型跨膜蛋白，正常情况下主要表达于多种组织、器官中上皮细胞近管腔或腺腔面，呈顶端表达，极性分布，在正常细胞上的表达不引起免疫应答反应。而当其发生表达量的增高、分布极性的消失或结构糖基化不全等改变时，MUC1这种广泛分布于肿瘤细胞表面的糖蛋白随之成为了能被免疫系统识别的新表位，即成为了一种潜在肿瘤生物治疗的新靶抗原[5-7]。

肿瘤免疫靶向治疗中的一个重要途径就是利用理想的靶向抗原的基因修饰DC来诱导机体产生抗肿瘤的免疫应答[8]，主要就是T细胞免疫。但其依赖于有效地抗原提呈，DC就是一种功能最强的专职提呈细胞 (antigen presenting cell，APC)，也是目前发现的唯一能激活初始T细胞 (naive T cell)的APC[9]。所以我们利用DC这种强大的抗原提呈功能，将MUC1基因真核表达质粒修饰于DC后，通过启动MHCΙ类途径提呈内源性抗原MUC1，以激发产生针对膀胱肿瘤的特异性的免疫应答。

我们在本试验中尝试使用了葡聚糖磁性纳米颗粒DMN这种新型的超顺磁性的转染载体，在外加固定磁场的作用下，通过其较强的磁性，使DMN-PLL-DNA复合物定向移动并紧密吸附于单层DC表面， 以利于DMN以及携带的基因更容易穿过细胞膜进入DC中并成功表达于细胞表面。但是pEGFP-C1-MUC1质粒分子量较大，也从某种程度上增加了DMN转染的难度，试验中转染24 h后荧光显微镜下能够观察到部分DC细胞表面出现明显的绿色荧光，RT-PCR法可以显示明显的MUC1的条带，这些均证明转基因的DC表面已经成功表达了pEGFP-C1-MUC1，其转染效率约为10％左右。在转染过程中虽然约有70％的DC死亡，估计是因为体外磁场作用下DMN超顺磁性的外力作用或pEGFP-C1-MUC1质粒分子量过大所致；但是存活下来并成功转染MUC1基因的DC却具有强大的抗原提呈能力，因此10％的转染效率同样可以满足试验需要。

Pecher等[10]报道以Liposomal将MUC1 cDNA转染DC，结果显示MUC1的表达率为2％～20％，均发挥了明显的抗肿瘤效果。同样，试验中转染MUC1基因的DC，虽然所占比例较少，但是其却得到了充分的刺激而活化，能够更为有效地促进DC诱导CTL产生，从而增强抗肿瘤的免疫应答的作用。实验显示转染MUC1基因的DC所诱导出的针对MUC1的CTL对BIU87 膀胱肿瘤细胞的杀伤率，高于转染空载体的DC以及阴性对照组DC (P < 0.05)，且随效靶比的增加，杀伤能力也不断增强。证明质粒pEGFP-C1-MUC1可以在成功转染DC后，在DC内转录、翻译成MUC1蛋白，不仅可以提呈到DC表面形成有效的抗原表位，随后成功的诱导出特异性杀伤性T细胞 (CTL)[11]。而且这种CTL可以有效识别BIU87膀胱肿瘤细胞表面相同的特异性MUC1抗原表位，通过穿孔素 / 颗粒酶途径，引起细胞肿胀、破裂。或者通过诱导凋亡途径特异性的诱导激活膀胱肿瘤细胞的自杀途径，最终导致靶细胞的凋亡和溶解。我们在透射电镜下观察到BIU87膀胱肿瘤细胞在与CTL混合培养6 h后出现了明显的染色质凝集等早期凋亡表现。

INF-γ是机体免疫机制中杀伤肿瘤细胞的一个非常重要的细胞因子，而成熟DC则能够激活T细胞分泌INF-γ，促进抗肿瘤的细胞免疫有效发生扩展。本试验显示针对MUC1诱导的CTL反应中，不仅是转染了MUC1基因的DC刺激T细胞分泌INF-γ的能力明显增强，而且即使转染空载体，也可以通过这种刺激促使DC的成熟，达到激活T细胞分泌INF-γ的目的，只是水平较低，无法进一步的触发特异性免疫反应的产生[12]。

近年来针对MUC1基因的DC疫苗得到了越来越多研究者的青睐，成为肿瘤靶向免疫治疗的热点。我们的研究用磁转染方式成功将MUC1修饰到DC表面，显著激活了DC抗原提呈功能，并且成功诱导出特异性的CTL，发挥高效而特异的抗膀胱肿瘤的免疫应答。这将为进一步开展基因治疗膀胱肿瘤的研究奠定理论和实验的基础。

 

参考文献

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[10] Soares MM, Mehta V, Frati L, et al. Transfected human dendritic cells to induce antitumor immunity[J]. Gene Ther，2000，7 (17)：1458-1466.

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[12] Pecher G，Spahn G，Schirrmann T，et al. Mucin gene  (MUC1) transfer into human dendritic cells by cationic liposomes and recombinant adenovirus[J].  Anticancer Res， 2001，21 (4A)：2591- 2596.

 

收稿日期： 2010-10-22； 修订日期：210-11-06

基金项目： 2009年深圳市科技计划项目(200903210）

作者简介： 孙  璇(1979-  ）女，湖北省武汉市人，博士研究生，主治医师，研究方向：泌尿外科肿瘤、结石以及尿流动力学。

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