川芎提取物的多模型体系抗氧化活性测定

 

李玉亮/彭  洁/梁  欣/海春旭*

(第四军医大学军事预防医学系毒理学教研室，陕西 西安  710032)

 

Antioxidation of Szechwan Lovage Rhizome  extracts in vivo and in vitro lipid peroxidation models

 

LI Yu-liang, PENG Jie, LIANG Xin， HAI Chun-xu*

(Department of Toxicology, School of Military Preventive Medicine, the Fourth Military Medical University，Xi’an 710032, China)

 

【摘要】 目的：  研究川芎醇提物和水提物在几种自由基体外模型中的抗氧化作用位点与活性强度，以及此两种提取物在小鼠氧化损伤模型中的综合抗氧化作用。 方法： 建立DPPH体系，观察川芎醇提物和水提物对DPPH自由基的清除率；建立·OH和O2-.          化学发光体系观察川芎的两种提取物对发光强度的抑制作用；采用CHP、Vc /Fe2+和CC14/NADP+作为激发剂，建立微粒体脂质过氧化(LPO)损伤模型，观察川芎两种提取物对MDA生成的抑制作用。建立小鼠氧化损伤模型，观察川芎两种提取物对SOD和CAT蛋白表达水平的影响，以及对MDA生成的抑制作用。结果： 在DPPH体系中，川芎的醇和水两种提取物对DPPH的清除率均显著高于对照组(P<0.01)，且呈明显剂量-效应关系，川芎醇提物和水提物对DPPH的IC50分别为3.47和6.19 mg/ml；在两种化学发光体系中，川芎的醇提物和水提物对O2-.和·OH的清除率均显著高于对照组(P<0.01)，且呈明显剂量-效应关系，川芎醇提物对O2-.和·OH的IC50分别为2.56和4.21 mg/ml，水提物对O2-.和·OH为2.34和2.80 mg/ml；3种LPO损伤模型中川芎两种提取物各浓度组的MDA含量均显著低于对照组(P<0.05)；在体内实验中，与对照组相比，川芎水提物和醇提物组均明显降低肝组织和血清内MDA的含量(P<0.05)；川芎水提物和醇提物能明显提高肝组织内SOD蛋白表达水平；川芎醇提物可以提高肝组织内CAT蛋白表达水平。结论：川芎提取物在几种体外模型和体内模型中均具有较好的抗氧化作用。

【关键词】 川芎； DPPH； 化学发光； 脂质过氧化； 抗氧化作用

   中图分类号：R285.5     文献标识码： A      文章编号： 1004-616X(2011)02-0087-06      doi: 10.3969/j.issn.1004-616x.2011.02.002

 

【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To study the antioxidative characteristics and activities of the ethanol and water extracts of Szechwan Lovage Rhizome(SLR) in several free radical models in vitro and in oxidative- damage model in mice. METHODS： The DPPH system model was applied to observe the inhibitory rates of DPPH radicals by different concentrations of SLR extracts.  The chemiluminescence system models for determination of ·OH and O2-. were built to observe the inhibitory rates of luminous intensity by different concentrations of SLR extracts. The microsomal lipid peroxidation model stimulated by CHP, Vc /Fe2+ and CC14/NADP+ was established to observe the inhibition of MDA by different concentrations of SLR extracts. The oxidative-damage model in mice was built to observe the inhibitory rates of MDA and changes of liver protein CAT and SOD expressions. RESULTS: In the DPPH system, the inhibitory rates of DPPH radicals by the two SLR extracts were significantly higher than that in control group，with an evident dose-effect relationship. The IC50 of DPPH radicals by the ethanol and water extracts of SLR were 3.47 mg/ml and 6.09 mg/ml, respectively. In the two chemiluminescence systems, the inhibitory rates of ·OH and O2-. by different concentrations of SLR extracts were significantly higher than that in control group again with an evident dose-effect relationship. The IC50 of O2-. and ·OH by the ethanol extracts of SLR were 2.56  mg/ml and 4.21 mg/ml, respectively, and the IC50 were 2.34 mg/ml and 2.80 mg/ml, respectively, by the water extracts. Compared with that in control group, the content of MDA in the three LPO models was decreased significantly(P<0.05) at different concentrations and had a dose-effect relationship. In vivo studies, after SLR oral administration, decrease of MDA was observed in liver and serum. The expressions of SOD and CAT were increased by ethanol extracts. Water extracts only increased the expression of SOD but that of CAT was not altered. CONCLUSION：In several in vitro and in vivo models described above, the ethanol and water extracts of SLR exhibited effective antioxidative effects.

【KEY  WORDS】 Szechwan Lovage Rhizome；DPPH；chemiluminescence；lipid peroxidation antioxidation

 

肿瘤是严重威胁人类健康的疾病。目前在我国城市人口中，肿瘤居死因第1位。在诱发肿瘤的多种因素中，自由基对生物大分子(特别是DNA)的氧化损伤被认为是启动和促进肿瘤发生的最重要因素[1]。植物性抗氧化剂的筛选，是最近几年国际上非常关注的研究领域。本实验室在从事多年的自由基生物学和抗氧化剂研究中，建立了一套代表不同生物活性的筛选方法和抗氧化剂筛选技术平台，利用这些方法和技术平台进行了大量研究，取得了比较理想的结果。

中药川芎为伞形藁本属植物川芎(Szechwan lovage rhizome, SLR)的干燥根茎，始载于《神农本草经》。其性温，味辛，微苦，归于肝、胆、心包经。具有活血行气祛风止痛之功效，常用于血瘀气滞所致的月经不调，经闭、痛经，胸肋疼痛，跌打肿痛，头痛，风湿痹痛等疾病。近年来，川芎的临床应用也取得了可喜的进展。文献报道[2]，川芎具有一定的抗氧化作用。随着川芎在临床应用的不断扩大，其在清除自由基方面的作用逐渐受到重视，我们在本实验中观察了川芎提取物对自由基的清除作用和量效关系。

　　

1  材料与方法

1.1  主要材料与设备

二级雄性SD大鼠20只，体质量180～220 g；二级昆明小鼠48只，体质量18~22 g，均由第四军医大学实验动物中心提供；川芎提取物由本教研室提取；鲁米诺、硫代巴比妥酸(TBA)、黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶(xanthinoxidase，XO)、过氧基异丙苯(cumene hydroperoxide， CHP)、辅酶II(NADPH)、2, 2'-diphenyl-1-picrylhydrazyl  (DPPH), 3K30型台式高速冷冻离心机均为美国Sigma公司产品；MDA标准品为德国Merck公司产品；牛血清白蛋白为江苏华美试剂公司产品；过氧化氢、三羟甲基氨基甲烷(trisaminomethane， Tris)、抗坏血酸、磷钨酸溶液等均为国产分析纯；Mini-PROTEAN电泳系统、蛋白半干转装置均为BIO-RAD公司产品。7200型光栅分光光度计为尤尼柯产品，IFFME型流动注射化学发光分析仪为西安瑞迈分析仪器有限责任公司产品。

1.2  方法

1.2.1  川芎提取物的制备  将川芎药材适当粉碎，称取250 g， 分别用3倍体积水或乙醇浸泡12 h，回流提取2次，每次30 min，合并提取液后减压浓缩干燥，分别制成水提物和醇提物。

1.2.2  微粒体的制备[3]  大鼠禁食24 h，颈椎脱臼处死，迅速取出肝脏，用预冷的生理盐水洗去血污，按每克肝湿质量加入4 ml蔗糖Tris/HCl缓冲液(250 mmol/L，pH=4)，用电动匀浆器制成匀浆。操作全过程在0～4 ℃下进行。采用低温超高速离心法提取肝微粒体，-20 ℃保存。用前按每克肝湿质量用1 ml预冷的 KCl(0.15 mol/L)悬浮。采用Lowry’s法测定蛋白含量。

1.2.3  DPPH体系的建立   根据文献[4]的方法并略加改进。1 ml DPPH (500 mol /L，溶于80%的乙醇) 与等体积的川芎提取物(0.5 μmol/L，pH=7.4的磷酸缓冲液)混匀，在黑暗的环境中放置20 min。阴性对照以磷酸缓冲液代替中药提取物，重复3次测定平行样本，517 nm测定吸光度。计算半数抑制浓度(IC50)。

1.2.4  O2-.化学发光体系的建立  根据文献[5]的方法并略加改进。将0.6 ml鲁米诺 (1 mmol/L，溶于pH 为10.2 的碳酸缓冲液)，0.6 ml黄嘌呤(150 μmol/L，溶于pH为 10.2的碳酸缓冲液)，20 μl不同浓度的样本，0.01 ml XO(4×103 U/L，溶于pH 为7.8的磷酸缓冲液)混匀后，立即测量，记录60 s内化学发光动力学曲线。重复3次测定平行样本。计算半数抑制浓度(IC50)。

1.2.5  ·OH化学发光体系的建立  根据文献[6]的方法并略加改进。双蒸水配制0.05 mol/L的硼酸缓冲液(内含1 g/L的EDTA，0.2 g/L的CoC12·6H2O，用1 mol/L NaOH调节pH为9)；将硼酸缓冲液1 ml，5.6×10-4 mol/L的鲁米诺100 μl，不同浓度的样本25 μl，7.9 mol/L的过氧化氢25 μl，充分混匀后，立即测量，记录60 s内化学发光动力学曲线。重复3次测定平行样本。计算半数抑制浓度(IC50)。

1.2.6  微粒体Vc/Fe2+ LPO激发模型的建立[8]  配制Vc储备液(5 mmol/L)、FeSO4 ·7H2O溶液(50 μmol/L)、Tris/HCl(0.1 mol/L, pH=7.4)、KCl溶液(0.15 mol/L)、KCl-Tris/HCl、微粒体悬液、硫代巴比妥酸(TBA)。反应体系为：KCl-Tris/HCl缓冲液0.80 ml；样品0.30 ml；微粒体悬液0.10 ml；FeSO4 ·7H2O溶液0.15 ml；Vc溶液0.15 ml。以上试剂强力振荡混匀，37 ℃水浴15 min。10%三氯醋酸3 ml终止反应，混匀。冰浴放置15 min。3 000 r/min离心10 min。取上清2 ml，加入0.67% TBA 2 ml，混匀。100 ℃孵育10 min。冷却至室温，722型光栅分光光度计535 nm波长比色，读取D(535)值。根据求出的MDA标准曲线，计算出相应的MDA含量。每组设3个平行样。同时，设阳性对照(用DMSO替代抗氧化剂)。以不同浓度的MDA标准品作标准曲线，拟合标准曲线方程，由此计算各组的TBA反应物含量。

1.2.7  微粒体CHP脂质过氧化(Iipid peroxidation， LPO)激发模型的建立[7]  根据文献[16]进行实验。缓冲液的配制同1.2.6。反应体系为：KCl-Tris/HCl缓冲液1.10 ml；样品0.15 ml；微粒体悬液0.10 ml； CHP溶液0.15 ml。操作步骤同1.2.6。

1.2.8  微粒体CC14/NADP+ LPO激发模型的建立[8]  配制基本缓冲液(0.15 mol/L KCl，0.10 mol/L Tris/HCl， 41.72 g/L G-6-P，0.85 g/L G-6-P Deh，7.00 g/L NADPH， 5.08 mg/L MgCl2·6H2O)。反应体系为：KCl-Tris/HCl缓冲液1.85 ml；储备液0.3 ml；加入物(空白对照和阳性对照加水) 0.5 ml；微粒体悬液0.3 ml；CCl4/乙醇(V∶V=3∶100) 0.05 ml。操作步骤同1.2.6。

1.2.9  氧化应激动物模型  健康雄性昆明小鼠48只，按体质量随机分为4组，每组12只。分别为正常对照组(C)、照射组(R)、照射+水提物组(R+W)、照射+醇提物组(R+E)。

C组动物给予生理盐水灌胃；R组动物给予60Co-γ照射(5 Gy全身单次照射，剂量率为303.81 cGy/min) ＋生理盐水灌胃；R+W组给予60Co-γ照射联合150 mg/(kg·d)川芎水提物灌胃；R+E组给予60Co-γ照射联合150 mg/(kg·d)川芎醇提物灌胃。从照射开始前1 d用受试物给各组动物灌胃，到处死前1 d终止，每天灌胃1次，共10 d。

1.2.10  取材   各组小鼠眼球取血后，颈椎脱臼处死，取肝组织，放入-20 ℃备用。

1.2.11  丙二醛的测定   用八木国夫法[9]测定血清和肝组织MDA含量。

1.2.12  蛋白表达量检测  取冻存的肝组织，按每10 ml/g加入蛋白裂解液[50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)，20 mmol/L NaCl, 5 mmol/L EDTA, 0.1%SDS]，用手持式匀浆器匀浆，20 000 g离心。吸上清，用Lowry’s法测定蛋白。在上清液中加入等体积的2 × SDS上样缓冲液，再加入5 mol/L DTT。煮沸5 min后，10 000 g离心10 min，取上清，-20 ℃保存。从各组样品中取20 μg总蛋白进行电泳(10%SDS-PAGE)，蛋白质转膜和Western blot杂交。用10%脱脂牛奶封闭NC膜1 h，TBST漂洗，分别滴加β-actin、SOD和CAT一抗在4 ℃下过夜。TBST漂洗4次。分别滴加相应的二抗37 ℃孵育1 h， TBST漂洗4次。用化学发光液对NC膜曝光，利用Quantity One 图像分析系统(Bio-Rad, Richmond, CA, USA) 扫描，处理。

1.2.13  统计学方法  实验数据用-x±s表示，采用SPSS 11.5 for windows统计分析软件进行线性回归分析和方差分析，应用Dunnet t 检验进行组间的两两比较。

　　

2  结  果

2.1  川芎提取物对DPPH体系的影响

与对照组相比，川芎两种提取物在给药浓度范围(0.125~8 mg/ml) 内，均可显著清除DPPH自由基(P<0.01)。且随着提取物浓度的升高，清除率逐渐升高(图1)。根据测得的已知样品浓度的清除率拟合曲线方程，计算川芎醇提物和水提物对DPPH的半数抑制浓度(IC50)分别为3.47和6.19 mg/ml。

2.2  川芎提取物对·OH化学发光体系的影响

与对照组相比，川芎的两种提取物在2~16 mg/ml 的范围内，均可显著清除·OH (P <0.01)。且随着提取物浓度的提高，清除率逐渐升高(图2)。根据测得的已知样品浓度的清除率拟合曲线方程，计算川芎水提物和醇提物对·OH的IC50分别为2.80和4.21 mg/ml。

2.3  川芎提取物对O2-.化学发光体系的影响 

与对照组相比，在1~15 mg/ml的范围内，川芎醇提物在1~15 mg/ml的范围内，和水提物均显著清除O2-. (P<0.01)。且随着提取物浓度的升高，清除率逐渐升高(图3)。根据测得的已知样品浓度的清除率拟合曲线方程，计算川芎醇提物和水提物对O2-. 的IC50分别为2.56和2.34 mg/ml。

2.4  川芎提取物对CHP激发的LPO损伤模型的影响 

与阴性对照组相比，川芎两种提取物各不同浓度实验组的MDA含量均显著下降(P<0.05，表1)。在浓度>2 mg/ml时，表现出一定的剂量-效应关系。两种提取物相比，10 mg/ml组醇提物MDA生成的抑制率低于水提物组(P<0.05)，浓度0.5、1和2 mg/ml组，醇提物组MDA生成的抑制率均高于水提物组(P<0.05)。

2.5  川芎提取物对Vc/Fe2+ 激发的LPO损伤模型的影响 

与阴性对照组相比，川芎两种提取物各不同浓度实验组的MDA含量均显著下降(P<0.05，表2)。且随着提取物浓度的升高，MDA含量逐渐降低，对MDA生成的抑制率逐渐升高，表现出一定的剂量-效应关系。两种提取物实验组相比，在浓度1，2和4 mg/ml组，醇提物组MDA生成的抑制率均高于水提物组(P<0.05)。

 

2.6  川芎提取物对CC14/NADP+ 激发的LPO损伤模型的影响 

与阴性对照组相比，川芎两种提取物各浓度组的MDA含量均显著下降(P<0.05，表3)。且随着提取物浓度的升高，MDA含量逐渐降低，对MDA生成的抑制率逐渐升高，表现出一定的剂量-效应关系。两种提取物组间比较，醇提物组MDA生成的抑制率均略高于水提物组，其中15 mg/ml组差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.7  川芎提取物对照射后小鼠MDA含量的影响   

如图4所示，小鼠在接受照射后，肝组织中的MDA含量显著高于对照组(P<0.05)。给予川芎提取物后，MDA含量与照射组相比均显著降低(P<0.05)，并且与对照组间差异不明显。

如图5所示，小鼠在接受照射后，血清中的MDA 含量显著高于对照组(P<0.05)。给予川芎提取物后，血清MDA含量与照射组相比均显著降低(P<0.05)， 其中醇提物组MDA的含量与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.8  川芎提取物对照射后小鼠肝组织中SOD和CAT蛋白表达的变化   

如图6所示，小鼠在接受照射后，SOD、CAT蛋白表达水平和对照组相比明显降低。给予水提物治疗后，SOD蛋白表达水平明显升高，但CAT蛋白表达水平无明显变化。给予醇提物治疗后，与照射组相比，SOD和CAT蛋白表达水平均明显升高。　　　　　　　　　

 

3  讨  论

川芎是一种临床广泛应用的中药，目前研究主要集中在其单体成份上，川芎嗪、香兰素和大黄酮均可作用于心肌细胞膜受体，其中，川芎嗪有可能作用于α受体，香兰素有可能作用于β1受体[2]。濮哲铭等[10]发现川芎嗪能通过阻断内皮素受体而防止心肌缺血的发生。沈建明等[11]认为川芎嗪可以减轻自由基损伤。

自由基在体内分布十分广泛，正常情况下与机体的抗氧化机制维持平衡，在病理状态下，如自由基数量升高或抗氧化机制失常，就会导致体内微环境处于氧化应激状态。大量研究表明 [12-13]自由基与癌症的发生有着密不可分的关系。自由基具有多种存在形式，自由基引发的氧化损伤反应也是多种多样的，而机体存在复杂的自由基反应系统，因此，单一的抗氧化剂不可能有效阻断这种“链式”的系统反应[14]。海春旭教授[15]在90年代初首次提出了“抗氧化剂复合链”理论：单一抗氧化剂很难表现出整体的抗氧化效果，必须针对自由基的多种存在形态和链式连锁放大反应，根据自由基的存在部位和特点、抗氧化剂作用对象、活性强度，脂、水溶性等差别，利用抗氧化剂具有相互替代、补充、协同和再生作用特点，有针对性地筛选、组合抗氧化剂，构成的“抗氧化剂复合链”，才会以防御系统形式抗衡自由基损伤。在抗氧化剂复合链理论指导下，我们建立了DPPH、化学发光、肝微粒体等自由基反应模型，来检测川芎醇提物和水提物的抗氧化活性。

DPPH是一种稳定的自由基，DPPH体系广泛地应用在植物或者食物生物化学中，用来评价化学物或者提取物清除自由基的能力[16-18]。本实验中，川芎的醇提取物表现出较强的抗自由基活性，对DPPH的抑制率可以达到90%以上，而水提物对DPPH的抑制率仅能达到60%左右。化学发光是一种间接检测自由基的方法，超氧阴离子自由基和羟自由基均可以使鲁米诺产生化学发光，记录发光强度，就可以间接反映自由基的量。从两种化学发光的实验结果可以看出，川芎两种提取物对化学发光值均有明显的抑制作用，而且有明显的剂量-效应关系，说明显著地抑制了O2-. 和·OH 两种自由基。在两种化学发光的体系中，川芎醇提物的IC50大于水提物，说明川芎水提物清除O2-. 和· OH两种自由基的能力强于醇提物。微粒体是细胞内质网的碎片，含有混合功能氧化酶系统包括细胞色素氧化酶P450(CYP450)，黄嘌呤氧化酶等多种同功酶。微粒体酶系统在代谢反应(包括氧化、还原、水解和结合等)过程中起着重要的催化作用。在氧化应激状态下，自由基作用于膜结构会攻击多不饱和脂肪酸，使其裂解生成MDA等终产物，发生脂质过氧化。MDA作为脂质过氧化损伤的产物，是反映氧化损伤的最简单、可靠的指标之一。本研究采用的微粒体LPO模型通过MDA含量的变化来评价川芎的抗氧化活性。3种模型分别使用了不同的激发体系：CHP、Vc/Fe2+激发体系代表非酶参与性反应，其中CHP代表有机物激发剂，VC/Fe2+ 代表无机物激发剂；CC14/NADP+ 代表酶参与性反应，包括黄嘌呤氧化酶、NADPH脱氢酶等酶促反应。在CHP模型中，低剂量1 mg/ml的川芎提取物表现出的抗氧化作用并不比高剂量差，这就表明，抗氧化剂的应用存在剂量的选择，合适的剂量对抗氧化剂发挥好的抗氧化效果有比较重要的意义。除此之外，在CHP、Vc/Fe2+ 和CC14/NADP+ LPO模型中，川芎两种提取物均有较强的抗氧化作用，在各给药浓度下，均能够显著地抑制MDA的生成，且有一定的剂量-效应关系。而比较两种提取物在3种LPO模型中的抗氧化活性，CC14/NADP+ LPO模型中，川芎醇提物对MDA生成的抑制率高于水提物，而在另外两个模型中川芎水提物对MDA的生成率均低于醇提物，说明不同的抗氧化剂清除不同自由基的作用是不一样的。小鼠在接受照射后，血清和肝组织中的MDA含量均显著高于对照组。水提物和醇提物组MDA含量明显低于照射组，说明川芎的水提物和醇提物可以有效的缓解动物体内氧化损伤状况。SOD和CAT是机体抗氧化酶类的重要组成部分，SOD将O2-. 转化为H2O2, CAT继续将H2O2转化H2O, 避免O2-. 继发转化成氧化性更强的自由基，两者联合起来构成了机体抗氧化的基本防线。本实验结果显示，在肝组织中，照射可以导致SOD和CAT活性下降，显著低于对照组，给予川芎醇提物治疗后，SOD和CAT蛋白表达水平均提高，给予水提物治疗后，SOD的蛋白表达水平提高，但CAT蛋白表达水平无明显变化，提示川芎醇提物可能通过提高肝脏SOD和CAT蛋白表达水平发挥有效的抗氧化作用，而水提物仅能通过提高肝脏SOD蛋白表达水平发挥其抗氧化作用。

实验结果表明，川芎提取物在体外模型和体内模型中均表现出较好的抗氧化活性。在不同的模型中，水提物和醇提物所表现出来的抗氧化活性是不一样的，这在一定程度上也反映了自由基反应的多样性和自由基系统的复杂性。单一的抗氧化剂很难发挥最好的抗氧化作用，有必要筛选、组合不同的抗氧化剂，使其抗氧化效果达到最佳。

 

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收稿日期： 2010-04-06； 修订日期：2010-11-11

基金项目： 国家自然科学基金(30872135)

作者简介： 李玉亮(1984-  )，男，北京市人，硕士研究生，研究方向：自由基生物学。E-mail: lzylws@sohu.com

﹡Correspondence to： HAI Chun-xu, E-mail：cx-hai@fmmu.edu.cn

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