红景天醇提物对乙醇诱导QZG细胞氧化损伤的保护作用

刘江正/海春旭*/梁  欣

(第四军医大学军事预防医学系毒理学教研室，陕西  西安   710032)

The protective activities of  Rhodiola ethanol-extract against alcohol-induced oxidative damage in QZG cells

LIU Jiang-zheng，HAI Chun-xu*，LIANG Xin

(Department of Toxicology, School of Military Preventive Medicine,the Fourth Military Medical University，Xi’an 710032, Shaanxi,  China)

【摘要】 目的： 研究乙醇对氧化应激损伤的作用特点和红景天醇提物的抗氧化作用。方法：采用DPPH自由基生成体系、体外鲁米诺化学发光反应(·OH和O2-.)体系观察红景天醇提物对DPPH自由基、·OH和O2-.化学发光强度的抑制作用以及剂量-效应关系。采用乙醇诱导人正常肝细胞系QZG细胞的氧化应激反应模型，观察红景天醇提物对乙醇诱导细胞活力和氧化应激损伤的保护作用。实验分设红景天醇提物3个不同浓度(50、100、200 mg/L)的预防给药组和治疗给药组、阳性对照组(200 m mol/L乙醇干预)和阴性对照组(不加受试物)。预防给药组用红景天醇提物预处理QZG细胞12 h后，再加入200 m mol/L乙醇处理6 h，治疗给药组采用红景天醇提物和乙醇同时处理QZG细胞6 h。用MTT试验和生化法测定细胞活力、细胞丙二醛(MDA)、还原型和氧化型谷胱甘肽(GSH、GSSG)和总巯基(T-SH)含量、过氧化氢酶(CAT)、超氧阴离子歧化酶(SOD)活力；免疫印迹法检测细胞抗氧化酶血红素加氧酶-1 (HO-1)和核因子相关因子2 (NRF-2)蛋白的表达。 结果： 红景天醇提物对自由基的生成具有显著的抑制作用，呈现较为明显的剂量-效应关系；红景天醇提物可有效保护乙醇所致的肝细胞活力损伤，且治疗组具有明显的剂量-效应关系。与阳性对照组相比，红景天醇提物干预组细胞的MDA含量和GSSG含量下降 (P < 0.05)，GSH和T-SH含量显著升高(P < 0.05)；CAT和SOD活性也显著升高(P < 0.05)。免疫印迹测定结果表明，红景天醇提物可以诱导HO-1蛋白和NRF-2蛋白表达上调(P < 0.05)。 结论： 红景天醇提物在体外自由基模型中具有较强的抗自由基作用，可保护乙醇导致的QZG细胞氧化损伤，其作用机制可能和抗氧化作用相关。

【关键词】 红景天醇提物； DPPH； 化学发光； 乙醇； 氧化应激

   中图分类号： R285.5      文献标识码： A      文章编号： 1004-616X(2011)02-0081-06      doi: 10.3969/j.issn.1004-616x.2011.02.001

【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To study the characteristics of alcohol-induced oxidative damage in QZG cells and antioxidant activity of Rhodiola ethanol-extract.  METHODS： The DPPH system and chemiluminescence system models for determination of  ·OH and O2.-  were established to assess the inhibitive rates of DPPH radicals and chemical luminescence intensity of  ·OH and O2-. .  The oxidative damage model induced by ethanol in QZG cells was set up to measure the protective activities of Rhodiola ethanol-extract. Ethanol-extract of Rhodiola was divided into 3 different concentrations (50，100，200 mg/L) for the prophylaxis group and treatment groups，positive control group (200 mmol/L ethanol intervention) and negative control group (without test substance). Prophylaxis QZG cells were pretreated with Rhodiola ethanol-extract for 12 h，then 200 mmol/L ethanol added for 6 h. Treatment group received 200 mmol/L ethanol and Rhodiola ethanol-extract for 6 h. We used MTT test and biochemical method for determining cell vitality， malondialdehyde (MDA) and reduced and oxidized glutathione (GSH，GSSG) and total mercaptoacetic (T-SH) content and catalase (CAT)，superoxide dismutase enzyme (SOD) activity，Western blot to detect protein expression of antioxidant enzymes HO-1 and NRF-2. RESULTS: In the DPPH system and the two chemiluminescence systems，Rhodiola ethanol-extract could significantly inhibit generation of free radicals. In the oxidative damage model induced by et hanol in QZG cells，Rhodiola extract could effectively protect cell injury induced by alcohol，and the treatment groups showed an evident dose-effect relationship. Ethanol-extract of Rhodiola intervention groups reduced the contents of MDA and GSSG compared with positive control group (P<0.05)，and increased the content of GSH and T-SH.  The treatment groups also demonstrated high CAT and SOD activities. Western blot results showed that Rhodiola ethanol-extract could induce the protein expressions of antioxidant enzymes HO-1 and NRF-2. CONCLUSION：Ethanol-extract of Rhodiola could significantly inhibit generation of free radicals in three kinds of free radicals models in vitro，also effectively protected against ethanol-induced oxidative damage in QZG cells，may be  through its antioxidant activity.

【KEY  WORDS】 Rhodiola ethanol-extract ；DPPH；chemiluminescence；alcohol；oxidative stress

近年来，酒精(乙醇)滥用已经成为危害人类健康的一种生活因素。肝脏作为酒精代谢的主要器官，是酒精性损伤的主要靶器官之一。研究显示长期大量酒精摄入可以引起慢性酒精中毒，导致肝中毒损伤，甚至引起细胞突变、癌变等严重后果。本实验室在天然植物性抗氧化剂的筛选方面做了大量的研究，通过一套独特的抗氧化剂筛选技术平台[1]进行抗氧化中药的筛选，已取得比较理想的结果。通过前期的研究发现红景天醇提物在微粒体模型中具有良好的抗氧化活性[2]，但是对酒精性肝损伤能否通过抗氧化作用而发挥其保护作用还不得而知。

红景天属于景天科植物，是一类多年生草木或灌木珍稀野生植物，通常生长在海拔800~2 500米高寒地带，我国有70余种，主要分布于我国东北、华北、西北及西南的高寒山区，是一种珍贵中药植物。红景天生长环境恶劣，如缺氧、低温干燥、狂风、受紫外线照射、昼夜温差大，因而具有很强的生命力和特殊的适应性。祖国传统医学认为，红景天具有刺激神经系统、消除疲劳和预防高山症等作用。进一步研究提示，红景天还具有一定的抗癌及抗糖尿病作用。随着红景天药用价值越来越受到临床重视，它的药理作用也更加引起学者们的注意。为了探讨红景天对酒精性肝细胞损伤是否具有保护作用，这种作用是否与抗氧化作用相关，我们观察了红景天醇提物在体外自由基模型和酒精性肝细胞损伤模型中的活性作用、量效关系。

1  材料与方法

1.1  材料

鲁米诺、硫代巴比妥酸、黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶(xantllinoxidase，XO)、MTT、辅酶II(NADPH)、2，2-苯基-1-苦肼基(2，2'-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH)； MDA标准品为德国Merck公司产品；牛血清白蛋白为江苏华美试剂公司产品；过氧化氢、三羟甲基氨基甲烷(trisaminomethane，Tris)、乙醇、KCl、CoCl2和邻苯二甲醛等均为国产试剂(AR)；ECL 试剂盒(America) ； 抗兔HO-1、NRF-2多克隆抗体 (Santa cruz)；抗小鼠β-actin单克隆抗体(Santa cruz)；人类正常肝细胞系(QZG细胞)购于中国科学院上海细胞生物所。

7200型光栅分光光度计为尤尼柯产品，IFFME型流动注射化学发光分析仪为西安瑞迈分析仪器有限责任公司产品。Mini-PROTEAN 电泳系统和蛋白半干转装置均为BIO-RAD 公司产品。

1.2  红景天醇提物的制备[3]

干燥红景天200 g，以1∶8料液比(1 g克原料加8 ml液体)浸入70%乙醇，并于圆底烧瓶中经85℃回流提取2 h，同法共提取2次。合并提取液，趁热旋转蒸发，浓缩得到醇提膏，70 ℃烘干，检测水分小于5%，称重，计算提取率，置干燥器内保存备用。

1.3  红景天醇提物体外抗氧化活性测定方法

1.3.1  DPPH体系的建立  根据文献[4]的方法并略加改进。1 ml 500 μmol/L DPPH (溶于80%的乙醇) 与等体积的红景天醇提物(0.031 25~1.6 mg/ml)(0.5μmol /L，pH 7.4的磷酸缓冲液)混匀，在黑暗环境中放置30 min。阳性对照以磷酸缓冲液代替中药提取物，测定吸光度D(517)，重复3次测定平行样本。计算半数抑制浓度(IC50)。

1. 3.2  O2-.化学发光体系的建立 　 根据文献[5]的方法并略加改进。将1 mmol/L鲁米诺0.6 ml (溶于pH 10.2 碳酸缓冲液)， 150 μmol/L黄嘌呤0.6 ml (溶于pH 10.2碳酸缓冲液)，20 μl不同浓度的 (0.003 125~1.6 mg/ml) 红景天醇提物， 4×103  U/L 的黄嘌呤氧化酶0.01 ml(溶于pH 7.8 磷酸缓冲液)混匀后，立即启动化学发光，记录60  s 内化学发光动力学曲线。重复3次测定平行样本。计算半数抑制浓度(IC50)。

1.3.3  ·OH化学发光体系的建立  根据文献[6]的方法并略加改进。双蒸水配制0.05 mol/L的硼酸缓冲液(内含1 g/L EDTA，0.2 g/L CoC12·6H2O，用1 mol/L NaOH 调pH至9)；将硼酸缓冲液1 ml，5.6×10-4 mol/L 的鲁米诺100 μl，不同浓度的红景天醇提物(0.031 25~ 1.6 mg/ml)25 μl，7.9 mol/L过氧化氢25 μl，充分混匀后，立即启动化学发光，记录60 s内化学发光动力学曲线。重复3次测定平行样本。计算半数抑制浓度(IC50)。

1.4  红景天醇提物对乙醇诱导肝细胞氧化应激损伤模型的影响

1.4.1 细胞培养   正常肝细胞系QZG细胞培养于含体积分数为10%胎牛血清，1% L -glutamine，以及1×105 U /L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI-1640培养液中，置于37 ℃，5% CO2培养箱。

1.4.2  红景天醇提物对乙醇诱导肝细胞活力的影响   采用MTT实验。取处于对数生长期的QZG细胞接种于96孔培养板，每孔1×104个细胞，培养12 h后随机分为预防给药组(简称预防组)、红景天醇提物不同浓度的治疗给药组(简称治疗组)、阴性对照组和阳性对照组，共5组，每组6个复孔。阴性对照组不加受试物；阳性对照组只加入500 mmol/L乙醇培养液干预12 h；预防组分别加入浓度为50、100、200 mg/L的红景天醇提物(溶于培养基中)预处理12 h，换液后再加入含500 mmol/L乙醇培养基处理6 h；治疗组则在加入与预防组相同各浓度红景天醇提物的同时加入含乙醇(500 mmol/L)的培养液共处理6 h，置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养。乙醇干预结束后用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗1次，然后每孔加入MTT 10 μl (5 g/L)，继续培养4 h后，每孔加入150 μl DMSO溶解，用酶标仪于D(492 nm)波长处检测各孔吸光度，绘制各浓度组的反应曲线。

1.4.3  红景天醇提物对乙醇诱导肝细胞抗氧化酶活力的影响   取处于对数生长期的QZG细胞接种于6孔培养板，每孔1×104细胞 ，培养约12 h后，分为阴性对照组、阳性对照组和不同浓度的红景天醇提物组(简称红景天组)。阴性对照组不加受试物；阳性对照组只加入200 mol/L乙醇干预6 h，红景天组分别加入浓度为50、100、200 mg/L的红景天醇提物(溶于培养基中)预处理12 h，各浓度组再加入乙醇(200 mol/L)培养液共处理6 h，置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养。干预结束后用磷酸盐缓冲液( 0.01 mol/L PBS)清洗2次，然后每孔加入含1%Triton100的PBS缓冲液0.5 ml，在冰浴条件下裂解细胞，收集后反复冻融3次，2 000 g×10 min离心后取上清得细胞裂解液，每组3个样本，每个样本由6孔板中2孔细胞裂解后混匀得到，-20 ℃保存待测。测定细胞裂解液中氧化损伤的相关指标：MDA(malondialdehyde)、 GSH(glutathione)、GSSG(oxidized glutathione)、T-SH (total sulfhydryl) 含量。同时检测抗氧化酶活性相关指标：SOD(superoxide dismutase)、CAT(catalase)活力。采用八木国夫法测定MDA含量，荧光法测定GSH和GSSG含量，DTNB法检测T-SH含量，改良的盐酸轻胺法测定SOD活性，改良比色法测定CAT活力，蛋白质测定采用考马斯亮兰法。

1.4.4  红景天醇提物对乙醇诱导肝细胞抗氧化酶HO-1和NRF-2蛋白表达的影响   分组及干预方法同1.4.3 所述。处理细胞结束后，弃上清，用预冷的PBS洗2遍。每孔加入0.2 ml预冷的细胞裂解液，置于摇床上，冰浴条件下振荡30 min，将细胞匀浆液转移至冷却的离心管中；4 ℃条件下20 000 g离心20 min，收集上清液。取少量进行蛋白定量，其余尽快加入等体积2×SDS上样缓冲液、5 mol/L DTT(20 μg/ml样品)，沸水浴煮5 min，10 000g离心10 min，取上清分装保存于－80 ℃，提取细胞蛋白，采用Western-blot检测核因子相关因子2(nuclear factor erythroid-ralated factor 2，NRF-2)、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1) 蛋白的表达水平。以10%浓度的SDS-PAGE电泳。按照一抗蛋白特异性抗体：抗β-actin (1∶500)、抗NRF-2 (1∶500)、抗HO-1 (1∶500)，辣根过氧化酶标记的二抗1∶5 000(抗兔)孵育。ECL 试剂盒检测化学发光信号，结果用图形分析软件定量分析积分光密度值。目的条带蛋白表达水平以目的蛋白条带积分光密度值与β-actin 条带积分光密度比值表示。

1.5  统计学方法

数据用-x±s 表示，用SPSS 11.5统计分析软件进行数据线性回归分析和方差分析，应用Dunnet t检验进行组间的两两比较，以α = 0.05为检验水准。

2  结  果

2.1  红景天醇提物体外抗氧化活性测定

2.1.1  红景天醇提物对DPPH体系的影响   与对照组相比，红景天醇提物在0.062 5~1.6 mg/ml内显著抑制DPPH自由基的生成(P<0.05)。随着醇提物浓度的升高，抑制率也显著升高(P<0.05)，具有一定的剂量-效应关系(图1)。根据测得的已知样品浓度的抑制率拟合曲线方程，计算红景天醇提物对DPPH的IC50为2.92 mg/ml。

2.1.2  红景天醇提物对O2-.化学发光体系的影响   与对照组相比，在0.006 25~1.8 mg/ml的范围内，红景天醇提物显著抑制O2-.的生成(P<0.01)。随着红景天醇提物浓度的升高，抑制率逐渐升高(图2)。根据测得的已知样品浓度的抑制率拟合曲线方程，计算红景天醇提物对O2-.的IC50为0.21 mg/ml。

2.1.3  红景天醇提物对·OH化学发光体系的影响  与对照组相比，在0.006 25~16 mg/ml的范围内，除了0.025 mg/ml以下浓度的红景天醇提物表现的清除能力较弱外，其余浓度范围的红景天醇提物均显著抑制了·OH的生成(P <0.01)。且随着提取物浓度的升高，抑制率逐渐升高(图3)，具有良好的剂量-效应关系。根据测得的已知样品浓度的抑制率拟合曲线方程，计算红景天醇提物对·OH的IC50为1.15 mg/ ml。

2.2  红景天醇提物对乙醇诱导肝细胞氧化应激损伤的影响 

2.2.1  红景天醇提物对乙醇诱导肝细胞活力的保护作用  MTT实验表明，终反应浓度500 mmol/L的乙醇作用6 h可以明显地导致肝细胞活力下降，与阳性对照组相比，50、100、200 mg/L浓度的红景天醇提物无论是预防性给药还是治疗性干预，均在一定程度上减轻乙醇对肝细胞活力的损伤作用，在预防性干预实验中，红景天醇提物3个浓度组均具有良好的保护效应，在治疗性干预实验中，3个浓度组均减轻了乙醇对肝细胞的损伤效应(P<0.05)，其中100、200 mg/L组的保护效应比较明显，醇提物与其保护作用间具有剂量-效应关系。

2.2.2  红景天醇提物对乙醇诱导肝细胞抗氧化系统的保护作用   在氧化损伤指标方面，与阴性对照组相比，阳性对照组的GSSG和MDA含量均出现上升的趋势，红景天醇提物3个浓度组不同程度的改善了这一趋势，其中200 mg/L浓度组与阳性对照组相比差异具有统计学意义(P < 0.05)。与阴性对照组相比，阳性对照组的T-SH、GSH含量和GSH/GSSG比值均明显下降(P均<0.05)，而红景天醇提物3个浓度组均上升，其中100 mg/L浓度组的T-SH、GSH含量和GSH/GSSG比值较阳性对照组明显升高(P < 0.05)。见表1。

在抗氧化酶活性指标方面，与阴性对照组相比，阳性对照组的SOD和CAT活性均下降， 3个浓度组SOD和CAT活性均较阳性对照组升高，其中以100 mg/L 浓度组升高最为明显。见表2。

2.2.3  红景天醇提物对乙醇诱导肝细胞抗氧化酶HO-1和NRF-2蛋白表达的影响   见图3、表3。Western blot检测结果表明，乙醇干预后一定程度上抑制了细胞抗氧化酶HO-1和NRF-2的蛋白表达，而红景天醇提物一定程度上逆转了这种趋势。与阳性组相比红景天醇提物100 mg/L和200 mg/L浓度组的NRF-2和HO-1的蛋白表达明显增加(P＜0.05)。

3  讨  论

   红景天含有很多生物活性物质。研究表明红景天醇提物具有良好的生物学功能。金秀男等[7]研究发现红景天醇提物对链脲佐菌素所致实验性糖尿病大鼠具有一定的保护作用。红景天提取物还对油酸致豚鼠急性肺损伤具有显著的预防作用，其机制很可能是其抗氧化作用[8]。目前对红景天提取物的抗氧化活性的研究主要集中在各种单体成分上，尤其是红景天甙的研究。红景天苷对局灶性脑缺血再灌注损伤有保护作用[9]，还发现红景天甙能显著升高应激小鼠睾丸组织的总抗氧化力[10]。海春旭教授[11]首次提出的“抗氧化剂复合链”理论提示：由于自由基的多种存在形态和链式连锁放大反应特征，使得在实际工作中应充分根据自由基的存在部位和特点、抗氧化剂作用对象有针对性地筛选抗氧化剂，构成有效的“抗氧化剂复合链”，才能以防御系统形式对抗自由基损伤。本实验室前期研究发现红景天醇提物在体外微粒体脂质过损伤模型也具有较强的抗氧化作用，并存在一定的剂量-效应关系[2]。

在本实验中，我们采用了3种广泛应用的自由基清除模型检测红景天醇提物的抗自由基活性。其中DPPH体系广泛地应用于评价某种特定化学物或者提取物清除自由基的能力。在本实验中，红景天醇提物表现出了较为良好的抗DPPH自由基活性。O2-.和 ·OH化学发光体系是两种稳定的、能够分别生成O2-.和·OH的体系，可以用来检测外源性化合物对其清除能力。从实验结果可以看出，红景天醇提物对两种化学发光模型均有明显的抑制作用，而且这种作用具有明显的剂量-效应关系，说明红景天醇提物具有剂量依赖性的抑制O2-.和· OH两种自由基的产生。由于红景天醇提物对O2-.的IC50较·OH的小，可以认为主要抑制了O2-.的产生。以上结果表明红景天醇提物在体外具有良好的抗自由基和抗氧化作用。

大量研究表明酒精诱导氧化应激与乙醇代谢有关，人体内存在3种酒精代谢途径[12]，从而影响抗氧化系统。乙醇代谢在体内的经典途径是在乙醇脱氢酶的作用下，乙醇被催化为乙醛，如果机体摄入乙醇含量过大在代谢过程中可产生大量自由基从而造成氧化应激损伤[13]。通过大剂量乙醇诱导肝细胞发生氧化应激损伤，我们在细胞学上检测了红景天醇提物对酒精性损伤的保护作用。细胞活力的改变是反映氧化损伤的最简单、可靠的指标之一， MTT实验表明红景天醇提物无论是预防性干预还是治疗性干预均可以有效地保护酒精介导的细胞活力损伤。抗氧化防御系统相关指标的测定表明红景天醇提物可以在一定程度上保护细胞内还原性物质，减少细胞内脂质过氧化产物的产生。T-SH、GSH是细胞内重要的还原性物质，其水平的下降体现了细胞可能受到了氧化应激损伤，实验中发现除低剂量治疗组无改善酒精对GSH的耗竭外，其他剂量组均对体内还原性物质发挥了保护作用。中剂量的红景天醇提物还能提高细胞内两种重要的抗氧化酶SOD和CAT的活性，这可能在一定程度上解释了红景天醇提物对酒精性氧化损伤的保护作用，但本次实验中没有表现出良好的剂量-效应关系，这也体现了生物体内抗氧化防御系统和红景天醇提物成分的复杂性。

NRF-2是细胞调节抗氧化应激反应的重要转录因子。可以调控的第II 相解毒酶及抗氧化酶基因表达，增加细胞对氧化应激的抗性[14]。血红素氧化酶(HO) [15]对氧化应激所致的细胞损伤有保护作用，它能将有细胞毒性的血红素降解为胆绿素、CO及Fe2+ ，胆绿素能迅速转化为胆红素，这与预防氧化应激所致的细胞损伤作用有关。HO-1是血红素氧化酶在肝脏内表达的主要亚型[16]。我们发现大剂量乙醇干预后一定程度上抑制了细胞抗氧化酶HO-1和NRF-2蛋白的表达，红景天醇提物在一定剂量范围内可以增加这两种重要抗氧化相关蛋白的表达，这可能是其发挥抗酒精性氧化损伤的重要机制。本研究以“抗氧化复合链理论”为依据论证了红景天醇提物在化学发光模型和细胞模型中的抗自由基损伤作用，多层次论证了其抗氧化作用，同时在酒精性肝细胞氧化损伤模型中发现其可以通过诱导抗氧化酶HO-1和NRF-2的蛋白表达，提高细胞相应的抗氧化防御系统，从而发挥对酒精性氧化损伤的保护作用。

综上，红景天醇提物具有较好的抗自由基活性，并可通过诱导相应抗氧化酶蛋白的表达在一定程度上提高相应抗氧化酶的活力，减轻乙醇对肝细胞的损伤作用，提示红景天醇提物在预防酒精性肝细胞损伤方面具有一定的潜力。

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收稿日期： 2010-11-23；修订日期：2011-01-10

基金项目： 国家自然科学基金(30872135)

作者简介： 刘江正(1986-  )，男，湖北武汉人，硕士研究生，研究方向：自由基生物学。Tel：029-84774882-804，E-mail：liu.jiangzheng@ 163.com 

*Correspondence to：HAI Chun-xu，E-mail：cx-hai@fmmu. edu.cn

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