RNA干扰抑制乙型肝炎病毒研究进展

 

刘冬玲(综述)/黄天华*(审校)

( 汕头大学医学院生殖医学研究中心，广东   汕头   515041 )

 

【摘要】  RNA干扰 (RNA interference，RNAi)是由双链RNA (dsRNA) 所介导的细胞内同源基因转录后沉默现象，是生物体在进化过程中普遍存在的一种基因调控机制。在抗肝炎病毒领域，RNAi技术可以抑制病毒复制，阻断病毒蛋白表达，为抗乙型肝炎病毒(HBV)基因治疗提供了新的策略。本文对RNAi在抑制HBV复制表达中的应用、存在的问题及发展前景等作简要综述。

【关键词】  RNA干扰；乙型肝炎病毒；dsRNA；siRNA

 中图分类号： R34; Q291     文献标识码： A     文章编号： 1004-616X(2011)03-0242-03     doi: 10.3969/j.issn.1004-616x.2011.03.022

 

乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus，HBV)可以导致肝细胞持续性损害和肝纤维化，甚至发展为肝硬化、肝癌。据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染过HBV，其中约3.5亿人为慢性感染者，每年有超过60万人死于与HBV感染相关的疾病。目前的治疗药物如干扰素、核苷类似物等并不能直接清除人体内的病毒，并且由于撤药后复发及长期使用可产生耐药变异等原因，限制了这些药物的临床应用。为此，寻找新的治疗方法显得愈发重要。近些年发现的RNA干扰 (RNA interference，RNAi)是动、植物抵抗外来病毒感染，抑制病毒复制的一种重要细胞保护机制，为抗HBV基因治疗提供了新的策略。本文就RNAi在 HBV中的相关研究作一综述。

 

1  RNAi的作用机制

RNAi是指外源或内源性的一些短片段双链RNA (dsRNA)可以通过促使靶基因的mRNA降解来高效、特异地阻断靶基因表达的现象。自从1990年Napoli等[1]在植物中发现了RNAi以来，一系列的研究表明，RNAi广泛存在于自然界的各种生物体内，无论是较低级的植物、真菌、锥虫、囊虫、线虫等，还是较高级的哺乳动物和人类细胞。RNAi的作用机制尚未完全清楚，据目前的研究成果看来主要有3种形式，即转录水平、转录后水平和翻译水平。其中转录后水平是RNAi在各种生物中实现的主要方式，其机制研究也较深入。

转录后水平的基因沉默是DNA到mRNA的转录过程启动后，双链小分子干扰RNA (siRNA)通过RNAi机制，降解mRNA 或抑制mRNA翻译的过程，可分为起始、效应、扩增3个阶段。①起始阶段：外源或内源性的dsRNA与核酸内切酶RNase III家族的Dicer结合，以依赖ATP的方式逐步被切割成长约21～23 nt的siRNA片段，每个片段的3′端均有 2个碱基突出 (多为UU)。②效应阶段：在siRNA反义链指导下，双链siRNA与1个RNA酶结合形成沉默复合体 (RNA induced silencing complex， RISC)，之后siRNA双链解旋，正义链释放，激活RISC，激活后的RISC通过碱基配对识别互补的靶mRNA； siRNA反义链与mRNA 复合体换位，并在距siRNA 3′末端的12 nt处切割靶mRNA，从而实现对mRNA的降解。目前，精确切割的机制仍不清楚，这是当前的研究热点之一。③扩增阶段：siRNA反义链可作为一种特殊的引物，以靶mRNA为模板，在RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)作用下合成 mRNA 的互补链cRNA，cRNA/mRNA双链RNA在Dicer酶的作用下也被裂解成次级的siRNA，次级 siRNA 又可以进入下一轮循环，显著增加了对基因表达的抑制。哺乳动物体内的siRNA不具有扩增效应，而且dsRNA长度的改变可以引起不同机制的干涉效应。

 

2  RNAi在抗HBV中的作用

HBV属嗜肝DNA病毒，是目前已知感染人类的最小的双链DNA病毒。HBV基因组致密精巧，是一环状的部分双螺旋结构，长约3.2 kb，其中的2/3为双螺旋结构，1/3为单链，长链为负链，短链为正链。负链DNA含有4个开放阅读框架 (ORF)，分别称为S、C、P和X区。S区中有S基因、前Sl 和前S2基因，分别编码HBV的外衣壳蛋白 (HBsAg，PreS1与PreS2抗原)。C区中有C基因及前C基因，分别编码HBcAg及HBeAg。P区最长，编码DNA多聚酶等。X区编码的蛋白称为HBxAg，可反式激活细胞内的某些癌基因及病毒基因，与肝癌的发生发展有关。HBV转录产生3.5、2.4、2.1、0.8 kb等数种mRNA，只有3.5 kb的mRNA含有病毒DNA序列上的全部遗传信息，是病毒的前基因组 (pergenome)。正链 DNA 的5′端有一段短 RNA，与负链5′端低分子蛋白质一起作为DNA合成的引物，在其复制过程中，存在以RNA为模板合成DNA的逆转录现象，这一过程在细胞浆中完成，因此，只要阻断HBV RNA的表达，就能干预HBV的复制，这为RNAi在抗HBV感染中的应用提供了理论依据。

2.1  RNAi对HBV表达的抑制

病毒基因的表达包括两个步骤：转录和翻译，根据RNAi的原理，siRNA导入细胞发挥作用后，靶mRNA应该相应减少并引起mRNA翻译产物——蛋白含量的下降。

Shlomai等[2]率先进行了RNAi抗HBV的体外试验，他们采用pSUPER载体体内合成分别针对HBV C区 (2 191～2 209 nt)及X区 (1 649～1 667 nt)的含19个核苷酸的dsRNA，转染Huh-7细胞系，观察到病毒蛋白量明显下降，而且不同靶点其抑制效果有很大差异。此外，在HBV X基因上设计了4个沉默点突变后，pSUPER X对蛋白表达的作用完全消失。另外，将HBV基因组中的C读码框用绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein，GFP)基因替代后，会影响病毒多聚酶的合成，但这并未损害siRNA的抑制效果，也说明了RNAi的发生不依赖多聚酶，对病毒的作用机制是完全不同于核苷类似物的，因此，有可能发展为与拉米夫定、阿德福韦等核苷类似物作用机制和位点不同的抗HBV药物联合用药。

Konishi等[3]使用了人肝癌细胞系HepG2.2.15作为转染对象，此细胞系能稳定分泌病毒蛋白和病毒颗粒，产生主要的几种mRNA，是模拟HBV感染并整合至肝细胞基因组的较好细胞模型。在针对多聚腺甘酸位点的siRNA作用下，3.5 kb mRNA下降72%。除了在RNA水平作用外，siRNA同样在蛋白水平发挥了抑制效果：通过测定细胞分泌在培养液中HBsAg的滴度来评价 RNAi抑制病毒的效率，发现针对多聚酶区的siRNA为 78%，针对S区的siRNA为 42%，而作为阴性对照的随机siRNA 不能起到沉默RNA的作用。

Chan等[4]构建了针对HBV X基因的shRNA表达载体，并将其导入PLC/PRF/5HCC细胞中。结果显示，RNAi可有效的降低HBV mRNA的转录和蛋白的表达。Meng Z等[5]用核糖核酸内切酶制备siRNA (endoribonuclease-prepared siRNA，esiRNA)，由于esiRNA可以直接抑制长的靶序列，靶序列的基因变异对于它的作用影响较小，故能显著抑制HBsAg及HBcAg表达。

体内实验表明，无论是暂时感染HBV的普通小鼠、免疫缺陷小鼠还是HBV转基因小鼠，经siRNA治疗后，体内各种病毒蛋白及转录本含量均明显减少。汪光蓉等[6]通过水动力学方法构建了小鼠急性HBV感染的动物模型，将1.5倍的HBV真核表达质粒 (pHBV1.5)与针对HBV核心区的siRNA表达载体 (psiHBV4)共同注入小鼠体内，模型小鼠体内的HBsAg、HBeAg和相应的HBV mRNA均出现明显下降。通过暂时性质粒体内共转染方法获得的结果，为RNAi的抗病毒活性可以在动物体内发挥作用提供了重要证据。Uprihcard等[7]首次用能表达HBV特异性siRNA的重组腺病毒感染HBV转基因小鼠，成功地抑制了己存在于小鼠肝脏中的HBV基因的表达和复制，这一点对临床HBV慢性感染者siRNA治疗更具有指导意义。腺病毒载体的缺点在于其效力的衰减，以及由于先天及获得性免疫而引发的不良反应。为克服这些缺点，应用单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺基丙酸盐 (mPEG-SPA)修饰第一代表达抗HBV siRNA的腺病毒载体，结果证实这种修饰可以提高腺病毒载体在抗HBV感染治疗中应用的可行性[8]。

2.2  RNAi对HBV复制的抑制

HBV 持续复制是乙型肝炎感染慢性化的重要原因，抑制病毒复制也是治疗HBV感染的重要环节，许多实验证明了RNAi能有效抑制或阻止病毒复制。

Chen Z等[9]设计了针对HBV S区、P 区和前C区的siRNA，联合针对不同区域的siRNA 对HepG2.2.15细胞内HBV进行抑制，结果发现联合的抑制效果无论对病毒复制还是对抗原表达均有更强的作用。Jia等[10]利用包含嘌呤选择标志及人U6-RNA聚合酶Ⅲ启动子的逆转录表达系统将shRNA转导至HepG2.2.15细胞，以沉默HBV基因。结果提示，以逆转录病毒为基础的 RNAi技术在实验生物学及分子医学方面均有乐观的应用前景。

RNAi文库 (RNAi library)是人工构建的能通过诱导RNAi抑制众多不同基因表达的混合文库，可以用于建立功能缺陷的生物或细胞库，进行表型的筛选。众多针对不同基因的siRNA或siRNA表达载体或表达盒即构成有限的RNAi文库。沈薇等[11]应用RNAi文库感染HepG2.2.15细胞筛选HBV复制相关基因，发现DDB1 基因可能参与HBV复制。

罗祥基等[12]以HBs 基因为靶点，构建的基于microRNA的慢病毒RNAi载体能有效抑制HBV的复制和抗原表达。He Y等[13]通过制备靶向HBV核心抗原 (HbcAg)的纳米小干扰RNA (siRNA)， 利用U6启动子质粒转染入HepG2 2.2.15细胞，多种方法检测均显示转染后的细胞HBV核心抗原表达明显下降；其表面抗原、e抗原和HBV DNA值均较对照组降低。表明，RNA干扰联合纳米技术可明显下调HBV核心抗原的表达，抑制 HBV DNA复制。

RNAi不仅可以直接作用于HBV 基因组，也可以将病毒复制和转录过程中必需的关键性蛋白、核酸等作为目标，构建针对这些序列的siRNA。细胞La蛋白有许多功能，如参与tRNA前体的加工，HBV RNA 转录后的下调，在小鼠中还发现其与HBV RNA代谢有关联。郜玉峰等[14]以La为靶基因，设计并构建3个针对La不同位点的microRNA表达载体，通过脂质体方法转染HepG2.2.15细胞，RT-PCR和Western blot检测其对La mRNA和蛋白的抑制作用，乙肝5项定量和HBV DNA检测其对HBV的抑制作用。结果显示，靶向La的外源性miRNA能显著抑制靶基因的表达，进而抑制HBV的复制和表达。通过miRNA介导的RNAi对HBV和HBV复制相关宿主基因进行联合RNAi可能具有良好的应用前景。

 

3  问题与展望

尽管RNAi技术在抗肝炎病毒治疗研究中取得了喜人的成果，但RNAi技术抗病毒感染的研究要真正为人类基因功能研究和基因治疗发挥作用，还需解决下列一些问题：

1) 最佳靶位点的选择尚无根据。目前主要集中在S区和C区，也有靶向X区、DR1 、DR2和pol编码区的，或多靶点联合使用。虽然均有效果，但不同研究结果之间差异较大，何为最高效靶序列，仍未获共识。因此只能从众多基因中筛选，这可能由于病毒的mRNA序列埋藏在二级结构或高度折叠区，或者与某些蛋白质形成紧密的复合物，使siRNA难以接近mRNA。

2) siRNA转运入细胞的效率较低。真核细胞不易摄取外源性裸露核酸，因而导致转染效率低下，所以，有必要提高siRNA转运入细胞的效率。可能的解决途径如下：①改变给药途径；②应用病毒载体表达所需siRNA；③提高siRNA的定向转运能力，如在siRNA末端偶联上脂溶性物质可能会促进细胞对其摄取；④构建长时程RNAi模型，其中转座子是较常应用的方法；⑤利用肽转导域 (PTD)蛋白小段穿透细胞膜的能力，Akiko等[15]成功开发出将siRNA送入原始细胞的有效方法，他们将PTD与双螺旋RNA附着域 (double-strandedRNA-bindingdomain， DRBD)组成融合蛋白，并起名为PTD-DRBD。该融合蛋白掩盖了siRNA的负电性，结果能够进入细胞并将siRNA送入细胞质，促进基因释放出信使核糖核酸 (mRNA)，关闭致癌基因。融合蛋白对细胞或先天免疫反应无毒性，转录偏离目标变化极少发生。

3) siRNA在体内稳定性差，极易被体内的细胞RNA酶降解。血浆中存在的核酸酶可导致siRNA的降解，从而直接限制了RNAi在机体内的应用，必须有效地解决这一问题才能将RNAi应用于治疗目的。目前提高siRNA在体内稳定性的方法主要有下列几种：①siRNA骨架的修饰，主要是对核酸链中磷酸基团的化学修饰，如以硫置换氧形成磷硫酰、硼 (-BH3)置换氧等；②碱基的化学修饰，但是，通常情况下野生型siRNA的碱基被取代可能造成干扰效应下降；③核糖的化学修饰，主要发生在2′-羟基、4′-氧上。

4) RNAi的“脱靶现象”。以往多数学者认为RNAi是高度精确的，即使仅有一个碱基错配亦能使其效应明显下降。但近来研究证实RNAi还存在所谓的“脱靶现象”，指siRNA能造成非完全同源mRNA降解的现象。这种现象可能是由于siRNA与靶mRNA内的某些核苷酸摆动配对造成的，如G/U错配。计算机模型分析显示，21 nt的siRNA有助于提高干扰的特异性。

5) 对RNAi效应的调控。目前对RNAi的研究主要限于以双链干涉片段抑制特定基因的表达，对其调控涉及较少。siRNA较之单链反义寡核苷酸、核酶和脱氧核酶具有独特的、可能更理想的基因表达调控效果和开发前景。

6)目前在哺乳动物中运用RNAi抗病毒感染的研究多限于体外研究。RNAi作为一种基因治疗手段，其安全性，如是否有未知的副作用、是否会整合到人基因组中等仍是阻碍临床应用的重要问题，这些均需要在更接近于人体的大型动物模型 (如黑猩猩)中得到证实后才能真正在临床实践中应用。

7) 以目前对RNAi的理解，它还不能清除细胞核内的共价闭合环状DNA (covalently closed circular DNA，cccDNA)，且不能彻底地治愈乙型肝炎，这就决定了它还只能作为一种抑制性治疗方案，单独或与其它药物治疗、基因治疗方案联合使用。但只要RNAi持续发挥作用，在防止病毒感染新的细胞的同时，仍可以不断消耗cccDNA存量，直至cccDNA藏身的肝细胞自然死亡，被未感染的新生正常细胞替代。

8) RNAi抗HBV作用时间短暂。李绍祥等[16]构建了Ad/rAAV 杂合体病毒，作为抗HBV的shRNA表达框的载体，为解决RNAi抗HBV作用时间短暂的问题作了一些技术上的探索。

总之，近年来，各领域的学者们对RNAi机制进行了深入的研究，扩展了其体内外应用范围。尽管目前还存在前述这些尚未解决的问题，限制了RNAi的治疗应用，我们相信随着各种技术的完善，这些不足之处能得到妥善解决，RNAi有望进入临床应用，为战胜疾病如HBV等提供一个全新的基因治疗手段。

 

参考文献

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收稿日期： 2010-11-15；修订日期：2011-03-24

基金项目： 国家自然科学基金资助项目 (30972526)

作者简介： 刘冬玲 (1985-  )，女，河南省濮阳市人，硕士研究生，研究方向：生殖遗传学。

*Correspondence to：HUANG Tian-hua，thhuang@stu.edu.cn

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