水蛭素冻干粉对大鼠的致畸性研究

 

黄超培/何为涛/赵  鹏/李  彬/王彦武/傅伟忠/何  励/苏爱荣

(广西壮族自治区疾病预防控制中心，广西  南宁  530028)

 

Teratogenicity of lyophilized hirudin powder in rats

 

HUANG Chao-pei，HE Wei-tao，ZHAO Peng，LI Bin，WANG Yan-wu，FU Wei-zhong，HE Li，SU Ai-rong

(Guangxi Center for Disease Prevention and Control, Nanning 530028, Guangxi,  China)

 

【摘要】 目的： 检测水蛭素冻干粉的致畸性。 方法： 将60只妊娠大鼠随机分为水蛭素冻干粉(每克含3 mg、相当于50 抗凝血酶单位的天然水蛭素)312.5、1 250、5 000 mg/kg 3个剂量组，同时设蒸馏水阴性对照和阿司匹林(300 mg/kg )阳性对照组，共5组，每组12只。各组孕鼠于妊娠第6～15 天灌胃给予受试物，每天1次，连续灌胃10 d，于妊娠第20天解剖孕鼠，检查胎鼠外观、内脏和骨骼及生长发育等指标。 结果： 水蛭素冻干粉各剂量组的孕鼠体质量、窝质量、胎鼠体质量、身长、尾长、活胎率、吸收胎率及死胎率与阴性对照组比较，差异均无统计学意义 (P > 0.05)，未见胎鼠外观、内脏和骨骼发育异常及畸形。 结论： 水蛭素冻干粉在本实验条件下，对大鼠无母体毒性、胚胎毒性和致畸性。

【关键词】 水蛭素冻干粉； 大鼠； 胎毒性； 致畸性

 中图分类号： R973＋. 2     文献标识码： A     文章编号： 1004-616X(2011)03-0226-04     doi: 10.3969/j.issn.1004-616x.2011.03.017

【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To determine the potentially teratogenic effects of lyophilized hirudin powder in rats.  METHODS: Sixty pregnant rats were divided randomly into 5 groups, 3 groups treated with  lyophilized hirudin powder (contain 3 mg which was equivalent to 50 AT-U natural hirudin per gram) with doses of 312.5, 1 250, 5 000 mg/kg, one negative control(distilled water) and a positive control(300 mg/kg aspirin), 12 pregnant rats in each group. The drugs were given orally for 10 days from 6th to 15th day after gestation. At 20th day the rats were sacrificed to examine the appearance, viscera, bones and physical growth of the fetuses. RESULTS: The body weight of pregnant rats, litter weight, live birth  rate, fetal body weight and length in all treated groups were not significantly different from negative control group(P > 0.05), and no abnormality of organ or appearance was observed in the fetuses of treated groups. CONCLUSION: Lyophilized hirudin powder had no maternal toxicity，embryo toxicity and teratogenicity in rats at doses  tested.

【KEY  WORDS】 lyophilized hirudin powder； rat； embryo toxicity；teratogenicity

 

水蛭素(hirudin)是从水蛭(俗称“蚂蟥”)中提取的一种多肽类活性物质，是迄今为止发现的作用最强的特异性凝血酶抑制剂，具有很强的抗凝血、抗血栓及抗炎等多种药理活性，临床上用于治疗心肌梗死、冠心病、脑血肿等疾病[1－2]。近年来随着人工养殖水蛭的产业化发展，水蛭素又被应用于美容化妆品、保健食品等领域[3]，但目前水蛭素的毒理学研究资料很少，尚未见有致畸性的研究报道。为此，我们对水蛭素冻干粉的致畸性进行研究，为水蛭素产品的安全性评价提供实验依据。

1  材料与方法

1.1  受试物

水蛭素冻干粉，每克含3 mg，相当于50 抗凝血酶单位(anti thrombin unit，AT-U)的天然水蛭素，其余为辅料成分(甘露醇)，批号：20050718，为美容保健品，由南宁市某生物科技有限责任公司生产。

1.2  实验动物

选用广西医科大学医学实验动物中心(生产许可证号：SCXK桂2003-0003)繁殖的性成熟未产仔的Wistar种雌性大鼠120只，同种属雄性大鼠80只，饲养在清洁级实验动物房内(合格证号：桂医动字第23003号)，温度：22～25 ℃，相对湿度：55％～75％。

1.3  动物分组及处理

按文献[4]中的方法，根据受试物的小鼠经口LD50大于10 000 mg/kg[5]，故以大鼠的最大给药量5 000 mg/kg设高剂量组(以最大可灌胃浓度500 mg/ml的混悬液给药)，再设1 250、312.5 mg/kg 2个剂量组(受试物浓度分别为250、125 mg/ml)，同时设蒸馏水阴性对照和阿司匹林(300 mg/kg )阳性对照组。于下午6时让雌雄大鼠合笼交配，次日早作阴道涂片检查，镜下检查到精子计为受孕第0 天，受孕鼠称重、随机分成5个组。将雌雄鼠分笼，下午6时再让未受孕的雌鼠与雄鼠合笼，如此重复直至每组有12只孕鼠为止。受孕第6天，孕鼠称重，开始按10 ml/kg灌胃给予受试物及对照溶液，每天1次，连续灌胃10 d，即至受孕第15天 。

1.4  观察指标

受孕第20天处死孕鼠，取出子宫，称量窝质量后剖开子宫检查并记录吸收胎数、活胎数、死胎数，取出胎鼠称量活胎体质量、胎盘质量、测量胎鼠身长和尾长，检查胎仔外观形态，然后将一半活胎经Bouin 氏液固定2周，采用徒手切片法对胎仔内脏进行检查；另一半经95％乙醇溶液固定、透明和茜素红染色后在解剖镜下检查骨骼形态。

 1.5  统计学方法

应用 SPSS10.0统计软件分析数据。各组间孕鼠体质量、窝质量、胎仔体质量、身长、尾长及头骨缝隙宽度等的比较采用方差分析，活胎率、吸收胎率、死胎率及骨骼、内脏的畸形率采用χ2检验。

 

2  结  果

2.1  水蛭素冻干粉对孕鼠的一般状况、体质量及胚胎形成的影响

实验期间，各组孕鼠饮食、活动均未见异常，未观察到异常症状和体征。阴性对照和阳性对照组各有1只雌鼠空怀，其余雌鼠全部受孕。随着妊娠时间的增加，各组孕鼠的体质量均相应增长，各组孕鼠的体质量及增重之间的差异均无统计学意义(P > 0.05) 。见表1。

水蛭素冻干粉各剂量组的窝质量、活胎率、吸收胎率及死胎率与阴性对照组比较，差异均无统计学意义(P > 0.05)，阳性对照组的活胎率低于阴性对照组，吸收胎率则高于阴性对照组，差异均有统计学意义(P < 0.01)，见表1。

 

2.2  水蛭素冻干粉对胎鼠生长发育的影响

结果见表2。水蛭素冻干粉各剂量组胎鼠的体质量、身长及尾长，与阴性对照组比较，差异均无统计学意义(P > 0.05)，而阳性对照组胎鼠的体质量、身长及尾长均小于阴性对照组，且差异均具有统计学意义(P < 0.05)。

2.3  水蛭素冻干粉对胎鼠外观和骨骼发育的影响

 结果见表3。胎鼠外观检查，水蛭素冻干粉各剂量组和阴性对照组均未见异常，阳性对照组有1只胎鼠出现露脑。从表3可见，各剂量组胎鼠的囟门宽度与阴性对照组比较，差异均无统计学意义(P > 0.05)，而阳性对照组胎鼠的囟门宽度大于阴性对照组，差异具有统计学意义(P < 0.01)。

各组胎鼠均发现有胸骨缺失，阴性对照组胸骨缺失率为14.6％，阳性对照组为52.1％，明显高于阴性对照组 (P < 0.01)。312.5、1 250、5 000 mg/kg 剂量组的胸骨缺失率分别为15.9％、16.1％、14.8％，与阴性对照组比较，差异均无统计学意义(P > 0.05)。检查还发现，各剂量组及阴性对照组胸骨缺失的部位一般为第5胸骨，偶有同时缺第6胸骨，未见第2胸骨缺失，而阳性对照组则常伴有第6胸骨同时缺失，少数还伴有第2胸骨缺失，还有10只胎鼠出现肋骨变形。

2.4  水蛭素冻干粉对胎鼠内脏发育的影响

胎鼠经Bouin 氏液固定2周后，徒手切片检查，各组胎鼠的心、肝、肾、脾等内脏和脑均未发现畸形。

 

3  讨  论

水蛭素冻干粉作为一种原料，在一般护肤品中的添加量为每克1～5 AT-U水蛭素，特殊用途护肤品和活血化淤类药物用量可达每克10 AT-U。本实验研究的水蛭素冻干粉每克含3 mg(相当于50 AT-U)的天然水蛭素，其余成分为辅料甘露醇。水蛭素在临床上一般以静脉或皮下注射给药，但是中医使用水蛭要经过炮制和煎煮过程，并且近年来有实验结果证实经消化道给药水蛭素仍能发挥药理作用，近年还出现了一些水蛭素的口服制剂[6]，所以本实验采用经口给药。水蛭素对凝血酶的抑制作用非常强，如用量过大可导致出血，而水蛭是传统的中药，本草纲目记载其有破血、逐淤血、通经及堕胎作用，杨健等[7]曾报道从水蛭水煎剂分离出一种蛋白质对小鼠有较强的抗早孕作用，但至今尚未见临床上用水蛭或水蛭素终止妊娠或者导致流产的报道，亦未见有致畸性的报道。甘露醇在临床上主要用作脱水剂和导泻剂，近年来由静脉及口服给药甘露醇引起的不良反应时有报道，包括过敏反应、肾脏、肺脏、心血管及中枢神经系统损害等不良反应[8]，但未见有致畸作用的报道。

本实验在大鼠妊娠第6～15 天(致畸敏感期)，每天分别以312.5、1 250、5 000 mg/kg剂量的水蛭素冻干粉给予孕鼠灌胃，结果未见孕鼠出现中毒症状，孕鼠的体质量也未受影响，胎鼠活胎率为96.5％～98.2％，与阴性对照组(97.3％)无明显差异，吸收胎率、死胎率及胎鼠的体质量、身长和尾长与阴性对照组比较，均无明显差异(P > 0.05)，胎鼠的外观、内脏和骨骼发育正常，未发现有囟门增宽、骨骼钙化不全及畸形现象，而阿司匹林阳性对照组的胎鼠出现身体生长迟缓、骨骼发育障碍及畸形(P<0.05)。按3 mg/g的含量计算，高、中、低剂量组的天然水蛭素的剂量分别为0.94、3.75、15.0 mg/kg(相当于15.6、62.5、250 AT-U/kg)，在此剂量范围，未见水蛭素冻干粉对妊娠大鼠有母体毒性、胚胎毒性和致畸性。

由于天然水蛭素来源匮乏，致使它的研究与应用受到了很大限制，于是出现了重组水蛭素，这是通过基因工程获得的人工水蛭素，其性质与天然水蛭素基本相同，但活性略低。陆国才等[9]用重组水蛭素连续给猴子静脉给药 30 d研究其毒性，根据药效学剂量和参考对猴急性毒性试验结果，设1.0、3.0、6.0 mg/kg 3 个剂量组，结果对猴血液系统有一定的药理毒理作用，靶器官为血液系统，认为重组水蛭素对猴的安全剂量为1.0 mg/kg。在临床上，水蛭素的应用历史并不长，离规范化和标准化还很远。目前有关水蛭素临床应用的报道，大多没有标明水蛭素的具体剂量，一些报道虽标有水蛭素用量(一般在1.0 mg/kg以下)，但没有提及水蛭素的纯度。以AT-U来表示水蛭素的含量或者活力才比较科学和具可比性。而将水蛭素应用于美容化妆品，更是近几年的事情。虽然目前在市场和互联网上有不少含水蛭素的化妆品出售，但尚未见此类化妆品的功效和卫生指标评价报道，更未见此类产品的毒理学研究报道。笔者此前曾对该受试物的急性经口毒性和致突变性进行检测，结果属于实际无毒级，未见致突变作用[5]。由于本实验研究的水蛭素冻干粉每克仅含3 mg(相当于50 AT-U)的天然水蛭素，不足以完全代表水蛭素本身，但鉴于水蛭素研究的现状，本实验结果对评价水蛭素相关产品的安全性仍提供了重要的实验依据。

 

参考文献

[1]  何  群，黄俊军，蔡继明，等.  水蛭素治疗不稳定心绞痛疗效观察[J].实用中西医结合临床，2008，8 (3)：3－4.

[2]  程方敏，周风平，王忠功，等.  水蛭素注射液治疗脑出血的临床疗效观察[J].中国脑血管病杂志，2005，2 (11)：506－509.

[3]  佚  名. 南宁科康成功开发天然水蛭素等系列产品[EB/OL]. (2003-10-30)[2009-09-19]. http://www.healthoo.com/B0/200310/ B0-20031030084746- 154763 .asp.

[4]  中华人民共和国卫生部.  化妆品卫生规范：2002年版[S].北京:卫生部卫生法制与监督司编印，2002：139－141.

[5]  黄超培，赵  鹏，李  彬，等.  水蛭素冻干粉急性毒性和致突变性研究[J]. 癌变·畸变·突变，2010，22 (4)：312－314.

[6]  阎雪莹，唐晓飞，张学农，等.  重组水蛭素口服给药的抗凝效应[J].  现代生物医学进展，2008，8 (10)：1929－1930.

[7]  杨  健，王  线，贺云娇. 水蛭的抗早孕有效成分研究:Ⅰ [J]. 广东药学院学报，2002，18 (1)：34－36.

[8]  魏定基. 临床使用甘露醇的不良反应分析[J].  临床合理用药，2010，3 (1)：29－30.

[9]  陆国才，佘佳红，袁伯俊，等.  重组水蛭素对恒河猴长期毒性研究[J]. 第二军医大学学报，2004，25 (2)：172－175.

 

收稿日期： 2010－08－31； 修订日期：2010－09-29

作者简介： 黄超培(1962－  )，男，广西贵港市人，硕士，副主任医师，研究方向：卫生毒理学检验。Tel: 0771－2518982, E－mail: gxhcp@163.com

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