天绿香体外安全性毒理学评价研究

 

李   欣/陈美芬/陈秀娟/熊习昆/李   庆/王凤岩

( 广东省疾病预防控制中心卫生毒理所，广州  510030 )

 

Safety assessment of Sauropus androgynus L. Merr. in vitro

 

LI Xin，CHEN Mei-fen，CHEN Xiu-juan，XIONG Xi-kun，LI Qing，WANG Feng-yan

(Center for Disease Control and Prevention of Guangdong Province, Guangzhou 510030, Guangdong, China)

 

【摘要】 目的： 对野生蔬菜天绿香匀浆液的细胞毒性和遗传毒性进行评价。 方法：天绿香匀浆液分别以1 450、725、363、181、90.6、45.3、22.6、11.3 mg/ml浓度对人胚肺细胞MRC-5及人肝肿瘤细胞Hep G2染毒，24 h后以中性红摄入法对天绿香匀浆液的细胞毒性进行测定，计算IC50；根据细胞毒性结果，以72.5、36.3、18.1 mg/ml天绿香匀浆液处理Hep G2细胞，并同时设阴性对照组(仅加DMEM培养液)和阳性对照组[B(a)P]，进行体外微核分析，记录微核细胞数，计算微核率。结果：染毒24 h后观察到天绿香匀浆液对MRC-5细胞的IC50为133.1 mg/ml，而对Hep G2细胞的IC50为185.1 mg/ml，天绿香匀浆液对肺来源细胞的毒性明显大于肝来源的细胞。不同浓度天绿香匀浆液染毒的Hep G2细胞微核率与阴性对照组比较，差异均无统计学意义 (P > 0.05)。结论：天绿香匀浆液对细胞的损伤作用具有一定的组织选择性，对人肺组织来源的细胞损伤作用大于肝组织来源的细胞。未发现到天绿香对Hep G2细胞遗传物质具有损伤作用。

【关键词】 天绿香；细胞毒性；微核

 中图分类号： R394.6      文献标识码： A      文章编号： 1004-616X(2011)03-0222-04      doi: 10.3969/j.issn.1004-616x.2011.03.016

【ABSTRACT】 OBJECTIVE: The cytotoxicity and genotoxicity of Sauropus androgynus L. Merr.(SA) was assessed using human cell lines MRC-5 and Hep G2 in vitro. METHODS：MRC-5 and Hep G2 cells were treated with uncooked SA homogenate at 1 450，725，363，181，90.6，45.3，22.6，11.3 mg/ml for 24 h.  Then the cytotoxicity was studied using the neutral red intake test and the 50% inhibition concentration (IC50) was obtained. According to the cytotoxicity results，Hep G2 cells were treated with SA at 72.5，36.3，18.1 mg/ml，and in vitro micronuclei (MN) incidence was analysed. The number of cells with MN was recorded and the frequency was calculated. RESULTS：IC50  was 133.1 mg/ml in MRC-5 cells and  185.1 mg/ml in Hep G2 cells which were all treated for 24 h with SA. The cytotoxicity of SA on MRC-5 cells originated from human lung was more severe than Hep G2 cells originated from human liver. There was no significant difference between the groups of various SA concentrations and the negative control (P>0.05) in Hep G2 cell micronuclei test. CONCLUSION：SA homogenate could selectively damage MRC-5 cells originated from human lung，compared to Hep G2 cells originated from human liver. No obvious damage to genetic materials could be observed in Hep G2 cells.

【KEY  WORDS】 Sauropus androgynus L. Merr.；cytotoxicity；micronuclei

 

天绿香为大戟科守宫木属中的守宫木 (Sauropus androgynus L. Merr.，SA)，《本草纲目》中记载天绿香又名翘摇，生吃令人吐水，熟吃有活血、令人清健等作用。我国南方等地有较长的食用史，东南亚一带食用也较广泛，一直未见毒副作用的报道。但在1994～ 1995年间，台湾地区连续发生阻塞性细支气管炎的地方流行和爆发，被认为是生吃减肥蔬菜天绿香造成的，主要病理表现为2～4 mm 支气管的病变[1-2]。当时媒体和当局对公众提出了安全警告。2005年日本又有类似的报道[3]。Hsiue等[4]研究发现食用天绿香与人群的阻塞性通气损伤间有一定的剂量-效应关系。但动物试验研究均未成功复制出与人类相似的疾病表现。2005年郭巨先、杨暹等[5]研究报道天绿香30 d 喂养实验发现其对SD大鼠的肝、肾、脾、心、肺、睾丸等器官有损伤，并呈一定的剂量-效应关系。同时媒体报道该种野菜仍在大陆大量种植与销售，在华南乃至全国引起关注。随后有关部门提出天绿香不宜长期、规律食用的建议，但不断受到种植者和归国华侨的质疑。关于天绿香食用安全性是否符合食品毒理学安全性评价要求的问题一直少有研究报道，因此，本研究对其毒性做了初步的探讨。

 

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  样品制备   经华南师范大学生命科学院鉴定的、在海南采集的新鲜天绿香为试验材料。根据预试验结果，取样品870 g，加水粉碎后用匀浆机制备成匀浆，然后超声破碎 (振幅60％，时间1 min)，用纱布过滤去除残渣后滤纸过滤，取滤出液离心 (3 000 r/min， 10 min)，上清液于旋转蒸发仪 (30个大气压，100 r/min，30 ℃水浴)浓缩至60 ml，过0.20 μm的滤膜除菌后待用 (相当于每毫升匀浆液含14.5 g天绿香)。取除菌后匀浆液4 ml，以此为基础用PBS依次作2倍稀释得系列浓度的天绿香染毒液。

苯并(a)芘[B(a)P]和中性红购于Sigma公司，并分别以二甲基亚砜和PBS配制成储备液待用。

1.1.2  细胞株  人胚肺细胞MRC-5、肝肿瘤细胞Hep G2，购于中国科学院上海生命科学研究院，DMEM培养液加10%新生小牛血清，青、链霉素各100 U/ml， 37 ℃、5% CO2的保湿培养箱中进行培养。

1.2  方法

1.2.1  中性红摄入试验  人胚肺细胞MRC-5和人肝肿瘤细胞Hep G2复苏后传两代，稳定培养后在96孔培养板上接种细胞，每孔100 μl，接种密度为5×104个/ml， 培养24ｈ后弃去上清液后换无酚红、无血清的DMEM 培养基180 μl，每孔加入20 μl天绿香染毒液使其最终的染毒浓度分别为1 450、725、363、181、90.6、45.3、22.6、11.3 mg/ml，每个剂量组设定多个平行孔。染毒24 h后以D-Hanks液冲洗3次，加入含0.1%中性红溶液，37 ℃孵育3 h后，弃去中性红溶液，每孔加150 μl的细胞溶解液(水∶乙酸∶无水乙醇按体积比49∶1∶50混合)，静置15 min，后用酶标仪测定各孔在540 nm波长处的吸光度D(540)值。按下式计算抑制率：

抑制率 (%)＝[1－试验组D(540)值/对照组D(540)值]×100%

1.2.2  体外微核试验  试验设受试物组、阴性对照组及B(a)P (5 μg/ml)阳性对照组。将Hep G2细胞接种于6孔培养板中，每孔2 ml，接种密度为5×104个/ml，培养24 h后，更换新鲜培养液，根据细胞毒性试验结果，选择终浓度为72.5、36.3、18.1 mg/ml天绿香染毒液处理细胞，于培养箱中作用24 h后，弃去含受试物的培养液，用D-Hanks液洗细胞3次，加含有细胞松弛素B (3 μg/ml)的新鲜培养液，继续培养24 h，阴性对照组仅加DMEM培养液，每个剂量组设3个平行孔。按常规方法消化，低渗，固定，制片，Giemsa染色。对各试验组选取1 000个双核细胞，记录含微核的细胞数，并计算微核细胞率 (‰)。

1.2.3 统计学方法  采用SPSS 13.0统计软件分析实验数据，均数间的差异进行单因素方差分析和Dunett t 检验，检验水准α＝0.05。

 

2  结  果

2.1 中性红摄入试验结果

2.1.1  天绿香对MRC-5细胞生长的影响   见表1。根据MRC-5细胞生长抑制情况，可见天绿香浓度覆盖了从MRC-5细胞全部死亡到几乎不受影响的整个范围 。将天绿香浓度经对数转换后作浓度与细胞生长抑制率关系曲线，得回归方程y=23.508x-64.979，获得IC50＝ 133.1 mg/ml，结果见图1。

2.1.2  天绿香对Hep G2细胞生长的影响  根据Hep G2细胞生长抑制情况可见，天绿香浓度覆盖了可使50% Hep G2细胞死亡的范围 (见表2)，将天绿香浓度经对数转换后做浓度与细胞生长抑制率关系曲线，得回归方程y=15.36x－30.193，获得IC50＝185.1 mg/ml，结果见图2。

2.2   体外微核试验结果

天绿香各剂量组微核细胞率与阴性对照组比较差异无统计学意义 (P > 0.05)，见表3。

 

3  讨  论

在台湾和东南亚地区，人们认为天绿香有保护视力和减肥的功效，所以天绿香的食用范围很广，主要食用方法是打成匀浆后原汁和/或与其它果汁一起生食。但有研究报道生食3个月以上会造成紧缩型阻塞性细支气管炎，病情严重[6-7]。流行病学研究发现主要病理改变均发生在肺部，肺组织细胞似乎对天绿香损害作用较为敏感；肝脏是各种外来物质代谢的主要场所，近年来肝肿瘤细胞 (Hep G2)被认为是保留代谢酶的量和种类与体内最相似的体外培养细胞，能较好的反映外源化学物对人体的损害作用。所以本研究选择人胚肺细胞 (MRC-5)和人肝肿瘤细胞 (Hep G2)作为体外试验的指示细胞，对新鲜的天绿香匀浆液进行初步的体外毒性试验研究，观察天绿香的毒性作用是否具有组织特异性，并利用具有代谢能力的肝肿瘤细胞 (Hep G2)对天绿香的毒理学安全性做初步的评价，为其进一步的毒性机制研究提供线索。

中性红试验结果显示，不同浓度的天绿香匀浆液染毒24 h后对MRC-5细胞的IC50为133.1 mg/ml，而对Hep G2细胞的IC50为185.1 mg/ml，天绿香匀浆液对人肺组织来源的细胞毒性大于对肝脏组织来源的细胞毒性，在一定程度上反映了天绿香损害作用的组织选择性。

体外培养细胞微核试验在2010年已被OECD化学品检验指南正式纳入遗传毒性评价方法。我们用Hep G2的体外微核试验来评价天绿香的可能遗传毒性，但试验结果阴性，未观察到有统计学差异的微核细胞率升高。张静等[8]的研究也未观察到明显的遗传毒性， 黄琼等[9]的研究认为天绿香对免疫系统有一定的影响。免疫系统在天绿香损伤机制中的作用可能会是一个有意义的探讨方向。

本研究对天绿香匀浆液的细胞毒性和遗传毒性做了初步评价，为进一步的机制研究提供了可能的线索。

 

参考文献

[1] Lin TJ，Lu CC，Chen KW，et al. Outbreak of obstructive ventilatory impairment associated with consumption of sauropus androgynus vegetable[J]. J Toxicol Clin Toxicol，1996，34 (1)：1-8.

[2]  Chang YL，Yao YT，Wang NS，et al. Segmental necrosis of small bronchi after prolonged intakes of sauropus androgynus in Taiwan[J].Am J Respir Crit Care Med，1998，157 (2)：594-598.

[3]  Oonakahara K，MatsuyamaW，Higashimoto I，et al. Outbreak of bronchiolitis obliterans associated with consumption of sauropus androgynus in Japan - alert of food - associated pulmonary disorders from Japan[J]. Respiration，2005，72 (2)：221.

[4] Hsiue TR，Guo YL，Chen KW，et al. Dose - response relationship and irreversible obstructive ventilatory defect in patients with consumption of sauropus androgynus[J]. Chest，1998，113 (1)：71-76.

[5]  郭巨先，杨   暹，郭兰良，等. 华南野生蔬菜守宫木的毒理学研究[J].  华南农业大学学报，2005，26 (4)：140-141.

[6] Yu SF，Chen TM，Chen YH. Apoptosis and necrosis are involved in the toxicity of Sauropus androgynus in an in vitro study[J]. J Formos Med Assoc，2007，106 (7)：537-547.

[7] Epler GR. Constrictive bronchiolitis obliterans：the fibrotic airway disorder[J]. Expert Rev Respir Med，2007 1 (1)：139-147.

[8]  张  静，熊习昆，杨  颖，等. 守宫木致CHL及V79细胞染色体畸变作用[J]. 中国公共卫生，2009，25(3) 327-329.

[9]  黄  琼，熊习昆，黄建康，等. 守宫木提取物对小鼠脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞功能的影响[J]. 毒理学杂志，2009，23(6)：479-482.

 

收稿日期：2011-02-17； 修订日期：2011-03-25

基金项目： 广东省科技计划项目 (2006B20501009)

作者简介： 李  欣(1973-  )，女，医学硕士，副主任医师，研究方向：食品成分的功效学和遗传毒理学研究。E-mail：lixinsm@yahoo.com.cn

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