胡桃楸水提物的遗传毒性及抗诱变作用研究

 

田玉玲1，2/李淑红1，*/刘   冰3/刘   利1/崔黎明1

( 1．吉林大学白求恩医学院病原生物学教研室，

吉林  长春  130021；2．长春市儿童医院科研室，吉林  长春  130051；3．吉林大学白求恩医学院遗传学教研室，吉林  长春  130021)

 

Study on the genetoxic and anti-mutagenesis effects of  juglans mandshurica maxim extract

 

TIAN Yu-ling1，2，LI Shu-hong1，*，LIU Bing3，LIU Li1，CUI Li-ming1

(1. Department of Pathogenobiology, Noman Bethune College of Medicine Jilin University, Jilin 130021;  2. Changchun Children's Hospital, Jilin 130051;  3. Department of Medical Genetics, Noman Bethune College of Medicine Jilin University,  Jilin 130021, Changchun, China)

 

【摘要】 目的： 探讨胡桃楸水提物 (juglans mandshurica maxim extract，JMME)的抗诱变作用，及评价胡桃楸是否具有遗传毒性。 方法： 取80只昆明小鼠，随机分成不同JMME剂量的诱变组 (6.55、13.09、26.18 g/kg，分别为1/8、1/4、1/2 LD50)，不同剂量的JMME与环磷酰胺 (cyclophosphamide，CP) (0.04 g/kg)联合应用的抗诱变组，阴性对照组(NS)和阳性对照组(CP，0.04 g/kg)，共8组，每组10只。采用小鼠骨髓细胞微核试验(MNT)检测JMME是否具有遗传毒性及抗诱变作用。 结果： 阳性对照组微核发生率 (28.82‰) 明显高于阴性对照组 (2.65‰)，其差异具有统计学意义 (P<0.01)，而JMME各剂量组与阴性对照组间的差异无统计学意义 (P>0.05)。抗诱变各组的微核发生率与阳性对照组比较，除JMME低剂量组 (6.55 g/kg)无统计学意义外(P>0.05)，JMME中剂量组 (13.09 g/kg)和高剂量组 (26.18 g/kg)均显著低于阳性对照组 (P<0.05)，其中高剂量组明显低于中剂量组(P<0.05)。 结论： 在本实验条件下，JMME无遗传毒性，JMME对CP诱发的微核率，具有一定抵抗作用，且呈量-效关系。

【关键词】 胡桃楸水提物；急性毒性；诱变；抗诱变

 中图分类号： R394.6      文献标识码： A      文章编号： 1004-616X(2011)03-0216-03      doi: 10.3969/j.issn.1004-616x.2011.03.014

【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To discuss the mutagenesis and anti-mutagenesis effects of juglans mandshurica maxim extract (JMME)  and to evaluate whether  juglans mandshurica is genotoxic or not. METHODS：To choose 80 KM mice，and randomly grouped negative control group， positive control group (CP，0.04 g/kg)， water extract groups with different dose JMME (6.55，13.09，26.18 g/kg，1/8，1/4，1/2 LD50 )， and antimutagenicity groups with different dose JMME water extract and CP (0.04 g/kg). There were 8 groups with 10 mice each group. Test whether the JMME had genotoxicity and anti-mutagenic effect， marrow micronuclei test was carried out. RESULTS： The micronucleus incidence of negative control group was 2.65‰， and that of positive control group was 28.82 ‰  (P<0.01). But there were little statistical differences (P>0.05) between the water extract groups with different doses JMME and the negative control group. Comparing the antimutagenicity groups with the positive control group， the low dose (6.55 g/kg) group showed no statistical significance (P>0.05)， but both the intermediate dose (12.09 g/kg) group and the high dose (26.18 g/kg) group had significant difference (P<0.05)， and the high dose group was lower than the intermediate group  (P<0.05). CONCLUSION：Under our experimental conditions，JMME had no genotoxicity.  For the micronucleus incidence induced by CP， it had some dose-dependent anti-mutagenesis effect.

【KEY  WORDS】 juglans mandshurica maxim extract； genetoxic； mutagenesis； anti-mutagenesis

 

胡桃楸 (juglans mandshurica maxim)隶属于胡桃科胡桃属，俗名核桃楸。其作为药物早在民间得以应用，如胡桃楸根皮在韩国作为民间药物治疗癌症[1]， 在印度和非洲[2]，胡桃的提取物作为民间药物也使用了很多年；并且各学者对胡桃楸化学成分进行分析，证明胡桃楸含有胡桃醌、萘醌、黄酮、鞣花酸及没食子酸等，并进一步证实这些化学物质具有较强的抗肿瘤[3]、抗氧化、镇痛、抗炎和抗菌等作用。其抗肿瘤作用的同时亦具有一定的毒性作用[4-5]，但其是否具有遗传毒性，尚未见报道，因此，本研究通过急性毒性实验以确定半数致死量，然后采用小鼠骨髓细胞微核试验 (micronucleus test，MNT)进行遗传毒性检测，探讨胡桃楸水提取物是否具有遗传毒性和抗诱变作用，为胡桃楸在医学上的应用提供一些基础资料。

　　

1  材料与方法

1.1  样品制备

称取胡桃楸粉末250 g，加入去离子水3 750 ml浸泡1 h后，煎煮3次，煎煮时间：第1次2 h，第2次1 h，第3次30 min。煎煮液过滤合并，浓缩，至终浓度为5 g/ml的生药量，于4 ℃保存，使用前以生理盐水稀释到所需浓度。

1.2  实验动物、主要试剂及器材

昆明小鼠，体质量18～22 g，雌雄各半，由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供，清洁级，合格证号：SCXK(吉)2007-0003。

小牛血清(FBS)，北京鼎国生物技术有限责任公司；环磷酰胺 (cyclophosphamide，CP)，江苏恒瑞医药股份有限公司 (批号08012021)； 甲醇 (北京化工厂)； TDL-40B型低速台式大容量离心机 (上海安亭科学仪器厂)；光学显微镜 (OLYMPUS)。

1.3  急性毒性试验[6]

通过预实验测定最大全不致死量(the maximum non lethal dose，Dn)及最小全致死量(the minimum lethal dose， Dm)，按等比剂量设5个剂量组，剂量比值 k = 0.8。 昆明小鼠50只，随机分成5组，每组10只，雌雄各半，各组分别以80.0、64.0、51.2、41.0、32.8 g/kg 不同浓度胡桃楸水提物 (juglans mandshurica maxim extract，JMME) 灌胃(0.02 ml/g)，观察72 h，记录小鼠存亡情况。按Bliss法处理，DASver l.0 (Drug And Statisties for window) 计算小鼠LD50及95%置信区间。

1.4  分组及给药剂量

取80只昆明小鼠，随机分成阴性对照组、CP阳性对照组(0.04 g/kg)、不同JMME剂量的诱变实验组 (6.55、13.09、26.18 g/kg，分别为1/8、1/4、1/2 LD50)和不同剂量的JMME加CP (0.04 g/kg)的抗诱变实验组，共8组，每组10只，雌雄各半。阴性对照组、诱变组及抗诱变组的JMME均以灌胃给药，每天1次，连续给药3 d，各组给药体积均按0.02 ml/g。阳性对照组和抗诱变组的CP为腹腔注射给药，于处死前24 h一次性注射CP[7]。

1.5  骨髓细胞微核试验[7-8]

于末次给药24 h后颈椎脱臼法处死小鼠，剪取双侧股骨。用注射器 (6号针头)吸取胎牛血清1 ml，将骨髓冲入EP管，吹打成均匀混悬液。以1 200 r/min离心5 min，弃上清，沉淀混匀。吸取1滴混悬液，按常规血涂片法涂片，固定10 min，Giemsa染色，最后用去离子水冲洗。在油镜下观察标本，计数每只小鼠2 000个嗜多染红细胞(polychromatic erythrocytes，PCE)中带微核的PCE出现的频率， 同时计数200个PCE和正染红细胞(normorchromatic erythrocytes， NCE)，并计算小鼠骨髓细胞微核率(‰)和PCE/NCE比值。

1.6  统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件处理数据，组间数据比较进行单因素方差分析，以α = 0.05为检验水准。

　　

2  结  果

2.1  胡桃楸水提取物急性毒性试验结果

见表1。采用 Bliss 计算法处理，按生药量计算的半数致死量 LD50 值为 52.36 g/(kg·d)， 95%的可信限为49.22～55.98 g/(kg·d)。

2.2  胡桃楸水提取物对小鼠的诱变实验

结果见表2。实验组小鼠骨髓细胞微核率随着剂量的增加虽有增加的趋势，但与阴性对照组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，且显著低于CP组(P<0.01)。 各JMME剂量组PCE/NCE的比值与阴性对照组比较，差异亦无统计学意义(P>0.05)。说明受试药物对骨髓细胞无诱变作用，并且对骨髓细胞无明显抑制作用。

2.3  胡桃楸水提取物抗诱变效应

结果见表3。阳性对照组微核率明显高于阴性对照组，且差异具有统计学意义(P<0.01)。JMME各剂量组的微核发生率与阳性对照组比较，除低剂量组 (6.55 g/kg)差异无统计学意义外(P>0.05)，中剂量组 (13.09 g/kg)和高剂量组 (26.18 g/kg)均显著低于阳性对照组 (P<0.05)；其中高剂量组明显低于中剂量组(P<0.05)。JMME各剂量组PCE/NCE的比值，与阴性对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。可见JMME对CP诱发的微核率具有一定的抵抗作用，且随着剂量增加其抵抗的作用增强，具有一定的量-效关系。

 

3  讨  论

对生物体有害的物质往往通过对遗传物质的损伤而成为诱变剂，且遗传物质的受损程度是判断有害物质毒性灵敏度比较高的常规手段，相应判断一种物质是否有减毒作用 (即抗诱变作用 )则看该物质能否减少诱变物对遗传物质的损伤。小鼠骨髓微核试验[8]是遗传物质损伤的标准实验，已广泛应用于体内诱变实验和抗诱变实验。本实验结果显示阴性对照微核率(<5‰) 处于正常范围，实验组与阴性对照组比较，微核率无明显增加。表明其经体内代谢后无明显遗传毒性作用。同时JMME不同剂量组有不同程度抗诱变性，且有量-效关系。可能由于JMME中某些发挥作用的化合物随着药物浓度的增加，其抗诱变性也增加。

有关抗诱变性的机制，通常认为可能是在不同水平上抑制细胞诱变及致癌作用[9]。如在细胞外直接灭活外源性诱变物，降低或去除其致突变性，阻断遗传毒物的转变或阻止细胞对毒物的摄入；或在细胞内阻断毒物的作用，消除已存在致突变的自由基团或作用的DNA复制和修复过程等。但是JMME具体的抗诱变机制还需要进一步深入研究。

参考文献

[1]  Kim SH， Lee KS， Son JK，et al. Cytotoxic compounds from the roots of Juglans mandshurica[J]. J Nat Prod，1998，61 (5)： 643-645.

[2]  Talapatra SK，Karmachary AB，De SC，et al. (-)-regiolone，an tetralone from Juglans regia: structure， stereochemistry and conformation[J]. Phytochemistry，1988， 27 (12)： 3929-3932.

[3]  潘丽艳，郭喜平，李淑红，等.  胡桃楸树皮提取物对SMMC-7721、MCF-7和 A549肿瘤细胞的抑制作用及其机制[J].  吉林大学学报：医学版，2008，35 (1)： 124-127.

[4]  许绍惠，唐婉屏，韩忠环.  核桃楸毒性成分研究[J]. 沈阳农业大学学报，1986，17(2)：34-39.

[5]  许绍惠，许  泓. 胡桃属植物毒性成分及其应用[J].  沈阳农业大学学报，1990，21(2)：167-170.

[6]  《中药、天然药物急性毒性试验技术指导原则》课题研究组. 【Z】GPT2 - 1 中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则[S].  北京：中国标准出版社，2005 ：31

[7]  李   凡，刘永茂.  基础医学实验教材[M].  吉林：高等教育出版社，2002：20-30，187-188.

[8]  国家食品药品监督管理局.  【ZH】GPT2 - 1 药物遗传毒性研究技术指导原则[S].  北京：中国标准出版社，2007：6-7，30-32.

[9]  丁淑芹，金荣华.  黄芪甘草水提物的抗诱变作用[J].  医学理论与实践，2008，21(8)：43-46.

 

收稿日期： 2010-12-27；修订日期：2011-03-30

基金项目： 吉林省卫生厅科研基金资助课题(20060978)

作者简介： 田玉玲(1981-   )，女，内蒙古呼和浩特人，硕士，研究方向：病原微生物基础及临床检验。

*Correspondence to：LI Shu-hong， E-mail：lish@jlu.edu.cn

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