亲子鉴定中IdentifilerTM 系统15个STR基因座突变分析

 

张丹妍1/张丹媚2/万   凌1/吕   静1/陈晓星1/赵乐天1/李练兵1

(1. 重庆市人口和计划生育科学技术研究院/重庆市正鼎司法鉴定所/出生缺陷与生殖健康重庆市市级重点实验室，重庆  400020；2. 重庆师范大学，重庆  401331)

 

Gene mutation of 15 STR loci analysis of the IdentifilerTM system in parentage testing

 

ZHANG Dan-yan1， ZHANG Dan-mei2， WAN Ling1， LU Jing1，CHEN Xiao-xing1， ZHAO Le-tian1， LI Lian-bing1

(1. Science and Technology Research Institute of Population and Family Planning in Chongqing City / Chongqing Zheng-ding Judicial Identification Institute/Key Laboratory of Birth Defects and Reproductive Health of Chongqing, Chongqing 400020;

 2. Chongqing Normal University，Chongqing  401331, China)

 

【摘要】 目的： 观察和分析IdentifilerTM系统15个短串联重复序列 (short tandem repeat，STR)基因座在亲子鉴定中的突变现象。 方法： 应用IdentifilerTM荧光标记复合扩增试剂盒检测710例亲子鉴定案，对其中发现突变基因座的案件加用STRtyper荧光标记复合扩增试剂盒进行等位基因检测，或6个mini Y-STR基因座检测。 结果： 在认定亲子关系的615例中，IdentifilerTM荧光标记复合扩增试剂盒中的15个基因座确定7例突变，其中vWA基因座2例，D13S17、FGA、D18S51、D21S11、D19S433基因座各1例；一步突变的6例，二步突变的1例。其突变均来自父亲，且年龄均在35岁以上。 结论： 在亲子鉴定中用IdentifilerTM荧光标记复合扩增试剂盒检测到1～2个基因座不符合遗传规律时，有必要增加突变率低、稳定性好的STR基因座进行复核并排除近亲关系。

【关键词】  遗传学；亲子鉴定；短串联重复序列；基因突变

 中图分类号： D919.4      文献标识码： A      文章编号： 1004-616X(2011)03-0206-03      doi: 10.3969/j.issn.1004-616x.2011.03.011

【ABSTRACT】 OBJECTIVE: Observation and analysis of gene mutation of 15 short tandem repeat (STR) loci of the IdentifilerTM system in paternity testing. METHODS：Make use of the IdentifilerTM fluorescent multiplex PCR kit for indentification of 710 paternity cases. If the gene mutant was found we would be perform STRtyper fluorescent multiplex PCR kit or six mini Y-STR loci for detection of alleles. RESULTS： In the 615 cases identified in the parent-child relationship， seven cases of mutation were found in IdentifilerTM fluorescent multiplex PCR kit detection， of which 2 cases at vWA loci，and one each at D13S17， FGA， D18S51， D21S11 and D19S433 loci； step mutation in the six cases， two-step mutation in 1 case. Mutations were found in the father， aged over 35 years. CONCLUSION： 1-2 STR loci found are not in line with the expected by fluorescent multiplex PCR IdentifilerTM kit， it is necessary to increase STR loci with low mutation rate and good stability to confirm and to exclude consanguinity.

【KEY  WORDS】 genetics； parentage testing； STR loci； gene mutation

 

短串联重复序列 (short tandem repeat， STR)是广泛存在于人类基因组中的一类具有长度多态性的DNA序列，核心重复单位2～7 bp。STR基因座在人类基因组中含量丰富，为法医个体识别和亲子鉴定提供了高信息基因座的丰富来源[1]。目前，国内外亲子鉴定案例中多采用STR 基因座分型方法。由于STR核心序列短，环境、射线等许多因素均可能造成STR 基因变异，在遗传过程发生变异的机会较高，已引起法医分子生物学和遗传学工作者的重视[2-3]。近年来有关STR基因座突变成为备受关注的课题。陆续有学者报道亲子鉴定中1个或2个STR基因座发生突变，如霍振义等[4]在2 600例认定亲子关系的亲子鉴定例中观察到的14个STR基因座中等位基因突变的为59例，刘秋玲等[5]观察到的FGA和D7S820两个基因座同时突变。为避免基因突变导致错误地排除亲子关系，我们在亲子鉴定实践中，观察了615例已认定亲子关系的案例，发现有7例出现1个STR基因座突变现象，现报道如下，以期探讨基因座的突变类型和可能的机制。

 

1  材料与方法

1.1  材料

710例亲子鉴定均为2008～2010年6月由重庆市正鼎司法鉴定所承办的亲子鉴定案件。发生突变的7个家系中，三联体3例，二联体2例。每位当事人采集静脉血0.5 ml，用EDTA-Na2抗凝，置于－20 ℃冰箱冻存备用。IdentifilerTM 荧光标记试剂盒购自上海欧比特仪器有限公司；STRtyper 荧光标记试剂盒购自珠海科登生物工程有限公司。

1.2  STR基因座检测及分析

1.2.1  DNA 的提取  采用Chelex-100 法[6]提取血样本基因组DNA。

1.2.2  IdentifilerTM试剂盒检测  用IdentifilerTM荧光标记试剂盒复合扩增Amelogenin基因座和15个STR基因座 (D5S818，FGA，D3S1358，TH01，D13S317，D16S539， D2S1338，D19S433，vWA，TPOX，D18S51，D8S1179， D21S11，D7S820，CSF1P0)。通过ABI 3130分析仪进行毛细管电泳检测。

1.2.3  STRtyper试剂盒检测  用STRtyper 荧光标记试剂盒复合扩增Amelogenin基因座和9个STR基因座 (D18S1364，D12S391，D13S325，D6S1043，D2S1722，D11S2368，D22SGATA，D8S1132，D7S3048)。通过ABI 3130 分析仪进行毛细管电泳检测。

1.2.4  miniY-STR基因座检测  对于D18S51基因座发现的两步突变，除进行STRtyper试剂盒检测外，由于当事人 (有争议的父亲和小孩)均为男性，因此加测由四川大学华西基础医学与法医学院物证教研室提供的6个miniY-STR基因座 (DYS508，DYS522，DYS540， DYS556，DYS570，DYS576)。通过ABI 3130分析仪进行毛细管电泳检测。

1.2.5  统计学方法  用GeneMapper ID v 3.2软件进行结果分析，亲权指数 (paternity index， PI)、累积亲权指数 (cumulative paternity index， CPI)及相对父权机会 (relative chance of paternity， RCP)的计算参见文献[7]。判定亲生关系的理论依据是孟德尔遗传的分离律。

 

2  结  果

2.1  IdentifilerTM检测结果

710例亲子鉴定案例中，经检测615例被认定为亲子关系 (CPI均大于10 000，RCP均大于99.99%)。在认定为亲子关系的案例中发现7例有1个STR基因座不符合遗传规律，其中一步突变的基因座6例，两步突变的基因座1例。7个案例加测的STRtyper检测系统的分型结果均符合遗传规律。

2.2  miniY-STR 基因座的检测

对于发现的D18S51基因座两步突变的检案加做6个miniY-STR基因座检测，分型结果显示争议父亲与小孩的单倍型分型结果相同。考虑到Y染色体的父系遗传特点，详细询问了争议父亲的家族情况，排除了近亲因素影响。

2.3  突变的基因座及其突变次数

统计615例认定亲子关系的案件中，发现在15个STR基因座中的vWA、D13S17、FGA、D18S51、D21S11、D19S433等6个基因座存在突变，其突变次数为：D13S17、FGA、D18S51、D21S11、D19S433基因座各1次；vWA基因座2次。发现的突变均来自父亲，且父亲的年龄均在35岁以上，平均年龄为41岁。子代的新等位基因的来源根据子代新等位基因与亲代的差异大小来确定，差异小的定为新等位基因的来源。见表1。

 

3  讨  论

3.1  突变的机制

一般认为，STR的突变是由于在DNA复制过程中，DNA 聚合酶发生滑脱，导致重复序列中核心序列重复次数的改变而出现突变[8]。常用的STR基因座突变率在0.1%～0.5%[9]，STR 基因座的突变表现为重复单位数目的改变，主要分为单个重复单位突变 (single-step mutations)和多个重复单位突变 (stepwise mutations) 两类。我们观察到的7个家系中子代新生的等位基因的改变大多表现为1个重复单位的增加或减少，即一步突变，占突变事件的90%[5]。发现罕见的两步突变1例，两步突变的发生几率是单步突变发生几率的1%。

3.2  突变与性别、年龄

所观察到的6个STR基因座的核心重复序列的重复次数均为10次以上，是突变发生较高的STR基因座。据李秋阳等[10]报道，突变存在明显的性别差异，男女发生突变的比例为8∶1，并且突变与父亲年龄相关，突变率随父亲的年龄的增加而增加。本文观察到7例STR基因座突变均来源于父亲，年龄最小35岁，最大47岁，这一结果与李秋阳等的观察一致。

3.3  突变的应对

在亲权鉴定案件中要求有3个或3个以上STR 基因座的等位基因遗传违反孟德尔遗传规律，才能排除亲权关系[11]。若只有1个或2个STR 基因座违反孟德尔遗传规律时，为避免因STR 基因突变导致错误地排除亲子关系，应增加遗传标记进行检测，根据所测结果进行综合分析，以排除或认定亲子关系。本实验中所用IdentifilerTM系统荧光标记复合扩增试剂盒，常规检测15个STR基因座，对二联体常规检测24个STR基因座。若所测基因座符合遗传规律，累计父权指数>10 000，则认定亲父系(615例)。排除亲子关系 (95例)的标准为不匹配的STR基因座≥3。由于STR基因座具有一定突变率，当出现1～2个STR基因座不符合遗传规律时加做STRtyper荧光标记复合扩增试剂盒 (D18S1364， D12S391， D13S325，D6S1043，D2S1722，D11S2368，D22SGATA， D8S1132，D7S3048)做等位基因检测或6个mini Y-STR基因座的检测，若仍未发现不符合遗传规律的情况，经计算CPI大于10 000，则视为STR基因座属突变事件。本案例中该7个案件，均检测了24个STR 基因座，只发现1个STR 基因座违反孟德尔遗传规律，因此认为可能是在遗传过程中产生突变的结果。但突变的来源与机制尚待进一步对突变家系进行测序证实和研究。

 

参考文献

[1]  邓志辉， 吴国光， 程良红， 等. 13个STR基因座在亲子鉴定案例中的基因突变观察[J]. 中国法医学杂志， 2003，18 (3): 150-153.

[2]  唐   绮，李国良， 孙   瑜，等.  STR基因座遗传突变1例报告[J]. 江西医药， 2005，40 (10): 665-666.

[3]  孙耀东， 陈月勇， 任  宏. 1例亲子鉴定案中基因突变的解释[J]. 法医学杂志， 2005， 21 (4): 20-21.

[4]  霍振义， 刘雅诚， 唐   辉， 等. 2718例亲子鉴定结果分析[J]. 中国法医学杂志， 2003， 18 (1): 31.

[5]  刘秋玲， 伍新尧， 吕德坚， 等. 亲子鉴定中2个STR基因座突变1例[J]. 中国法医学杂志， 2001， 16 (4): 238-239.

[6]  Walsh PS， Metzger DA， Higuchi R. Chelex-100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material[J].  Bio Techniques， 1991，10 (4): 506-513.

[7]  侯一平.  法医物证学[M].  2版. 北京: 人民卫生出版社， 2004： 20-30.

[8]  庾  蕾， 李建金， 伍新尧， 等. 三个短串联重复序列基因座的等位基因遗传变异研究[J]. 中华医学遗传学杂志， 2002， 19 (4)： 308-311.

[9]  郑秀芬.  法医DNA分析[M]. 北京: 中国人民公安大学出版社， 2002：200-432.

[10]  李秋阳， 丰伟军， 杨庆恩， 等. 常用STR基因座突变的观察与分析[J]. 法医学杂志， 2005，21 (2)： 86-89.

[11]  李建金， 伍祥林， 吕德坚， 等. 短串联重复基因座突变率的分析研究[J].中国法医学杂志， 2000， 15 (Sup 1)：10-11.

 

收稿日期： 2011-01-13；修订日期：2011-03-13

基金项目： 重庆市人口和计划生育科学技术研究院科技项目(院0805)

作者简介： 张丹妍(1982-  )，女，硕士，法医师，研究方向：法医遗传学研究。E-mail:woody123456@163.com

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