海柳挥发性成分的分析

 

白雪婷1/陈一村1/陈伟洲2/雷华平3/石刚刚1，*

(1. 汕头大学医学院药理学研究室，广东 汕头  515041；2.  汕头大学海洋生物研究所，广东  汕头  515063；3. 中山大学生命科学学院，广东  广州  510275)

 

Analysis of volatile components of black coral

 

BAI Xue-ting1，CHEN Yi-cun1，CHEN Wei-zhou2，LEI Hua-ping3，SHI Gang-gang1，*

(1.Department of Pharmacology, Shantou University Medical College, Shantou 515041; 2. Marine Biology Institute, Shantou University，Shantou 515063; 3. School of Life Sciences，Sun Yat-sen University,  Guangzhou 510275, Guangdong, China)

 

【摘要】 目的： 提取分离海柳的挥发性成分并鉴定。 方法：采用二氧化碳超临界萃取出海柳挥发性成分，再经气质联用分析，结合保留指数计算，鉴定其成分。结果：通过气质联用分析，共鉴定出15种化学成分，包括磷酸三乙酯、丁羟甲苯、雪松醇、棕榈酸、角鲨烯、胆甾醇等。这些成分多具有生物活性。结论：首次揭示海柳的挥发性成分，海柳所具有的功效可能与其含有的生物活性成分有关。

【关键词】 海柳；二氧化碳超临界萃取；气质分析；保留指数

 中图分类号： R931.5      文献标识码： A      文章编号： 1004-616X(2011)03-0199-04      doi: 10.3969/j.issn.1004-616x.2011.03.009

【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To investigate the volatile constituents of black coral (BC). METHODS：The volatile constituents of BC were extracted by supercritical fluid extraction with carbon dioxide (CO2-SFE)，separated and identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) combined with retention index .  RESULTS：In total，15 components were reliably identified in BC and found to be biologically active. These included triethyl phosphate， butylated hydroxytoluene，cedrol，n-hexadecanoic acid，squalene and cholesterol.  CONCLUSION： It is the first time that volatile constituents of BC were presented. The functions of BC are related to the active chemical compositions. 

【KEY  WORDS】 black corals；CO2-SFE；GC-MS；retention index

 

海柳 (black corals，BC)别名角珊瑚，其外表虽与陆地上的柳树相似，但实则属于腔肠动物门、珊瑚纲 (六放珊瑚亚纲)、角珊瑚目、黑角珊瑚科、黑角珊瑚属、日本黑角珊瑚(Antipathes japonica brook)，多小枝黑角珊瑚(Antipathes virgata esper)的群体分枝。在潮汕地区，海柳因其天然独特的生态结构——像年轮一样的生长环[1]和不会腐化损坏的特性，广泛用于加工制作烟嘴、烟斗。海柳作为烟嘴加工材料，不仅因其具有极高的收藏价值，更重要的是本身所具有的药用功效。自《本草纲目》就有对海柳药用价值的记载。2009年管华诗院士主编的《中华海洋本草》总结海柳的功效有：止血、止痛、定惊；海柳煮汤吃，可治腰痛；海柳煲鸡头内服可止血；海柳做成烟嘴可供长期吸烟用。但尚未见其化学成分和药理毒理的研究报道[2]。目前仅有6篇文章报道从Antipathes subpinnata中分离得到了5种极性甾醇类的新化合物和4种对卤虫有致死性的新型多羟基甾醇，从 Antipathes dichotoma中发现对肝癌细胞Hep G2有细胞毒性的新型咔唑类生物碱antipathine，及其它从该物种中首次分离得到的成分[3-7]。另外，肖宗苗等临床观察发现黑角珊瑚治疗常见骨伤疾病有较好的疗效[8]。

众所周知，在香烟中含有大量氧化剂、自由基和致癌物质，会导致人体氧化损伤和细菌性感染，诱发多种癌症如肺癌、咽喉癌、口腔癌等。在对海柳的调查中我们获知，海柳烟嘴不仅具有过滤烟草中尼古丁、焦油的作用，还有凉喉解热、爽肺提神之感，能大幅度消除口臭、清热解毒，化痰止咳，以及起到润肺、清除肺部积热的作用。海柳烟嘴所具有的这些特性可能与其本身所含有的化学活性物质有关，因此我们选用对挥发性物质分离较为有效的二氧化碳超临界萃取 (supercritical fluid extraction with carbon dioxide， CO2-SFE)方法，然后通过气质联用 (gas chromatography- mass spectrometry，GC-MS)对提取的挥发性物质进行初步鉴定。

 

1  材料与方法

1.1  样品收集

样品收集区域：南澳岛，位于东经116°56'-117°09'，北纬23°23'-23°29'，北回归线横贯东西，广东福建两省交界。实验所用海柳原材料，由南澳岛海柳烟嘴制造商提供，海柳粉末在加工烟嘴过程中获得。

1.2  实验试剂与仪器

95%乙醇 (汕头西陇化工有限公司)，正己烷 (农残级ABSOLV，TEDIA，美国)，正构烷标准溶液C8-C20， C21-C40 (Fluka Chemika，瑞士)，CO2-SFE设备HA221-50-06 (南通市华安超临界萃取设备有限公司)，旋转蒸发仪R-210 (Buchi，瑞士)，干热式氮吹仪QGC-12T (上海泉岛科贸有限公司)，Agilent气质联用仪7890/5975C-GC/MS (Agilent Technologies，美国)。

1.3  实验方法

1.3.1  CO2-SFE   分别取海柳粉末985 g、984 g放置于5 L萃取釜中，加入1 L与样品等体积的95% 乙醇作为夹带剂，以提高萃取效率。采用的CO2-SFE萃取条件为：萃取釜压力30 Mpa，萃取温度45 ℃。从两个分离釜中收集萃取液，至无液体流出。

1.3.2  挥发性成分GC-MS分析   取0.5 ml海柳萃取液于样品瓶中，用氮气吹干，加入1 ml 正己烷作溶剂。

GC-MS 分析条件：HP-5ms 毛细管柱柱长30 m，内径0.25 mm，膜厚0.25 μm。程序升温条件：初始柱温100 ℃保持 2 min后，以10 ℃/min从 100 ℃升至140 ℃，然后再以1 ℃/min从 140 ℃升至280 ℃，最后保持5 min。高纯氦气 (99.999%)作为载气，流量0.8 ml/min。样品采用不分流进样。进样口温度和接口温度均为280 ℃。离子源为电子轰击源 (electron ionization source，EI) 电子能量70 eV，温度为230 ℃；溶剂延迟时间3 min；扫描范围50～550 m/z 。

对总离子流图中各峰经质谱扫描后得质谱图，通过NIST08标准质谱图库进行确认各化合物。在相同程序升温条件下，用正构烷标准溶液进样。与标准正构烷出峰位置进行比对，参照程序升温保留指数的公式计算。

RIx = [(tx-tn) / (tn+1-tn)] × 100

其中RIx 为程序升温中未知化合物的保留指数；tn，tn+1，tx 分别是相邻两个含有n 、n + 1个碳原子的标准正构烷，和未知化合物的保留时间。

 

2  结  果

为显示海柳CO2-SFE挥发性成分整体出峰情况，我们选择适当的纵坐标比例，总离子流图 (total ion chromatogram，TIC) 如图1所示。TIC中部每一处峰的丰度不强，是由于低浓度，不分流进样所致。其中phenol，2，2'-methylenebis [6-(1，1-dimethylethyl)-4-methyl-的丰度最高。共鉴定出15个化合物，包括：烷烃类、萜类、酯类、脂肪酸类和芳香类化合物 (表1)。

 

3  讨  论

对于挥发性成分，通常采用的萃取手段是溶剂萃取。但由于反应多是在高温高压下进行，不仅耗时，而且一些不耐高温的化合物很容易分解。超临界萃取是一种快捷、高效、有选择性的绿色萃取技术。它能够在低温低压的条件将萃取分离合二为一，且无溶剂影响，因而被广泛应用于实验研究和生产中，特别是对挥发油的萃取。目前超临界萃取90%选用二氧化碳作为流体[9]。挥发油一般以GC-MS为依据，鉴定分析混合物中的有机挥发性成分。 GC-MS结合保留指数(RI)比单用GC-MS，能够更为准确可靠的分析出复杂的挥发油组分[10]。本研究从海柳中鉴定出来的15个化合物均可局部放大为一个较好的峰形，通过安捷伦7890/5975自带NIST-08图库检索匹配度90以上的化合物，结合正构烷标准品进样对照，计算该化合物保留指数，继而查找文献，将与文献值相差不超过6～7个单位的化合物最终确定为待测物质的名称。海柳挥发性成分通过气质联用鉴定出30%，其余70%均未能通过检索图库并结合保留指数而确定该化合物的名称。原因是：①计算保留指数与文献值相差较大未能列出，仍需其他方法进一步确证；②一些化合物在NIST-08图库中检索的匹配度未能达到90以上，因而视为未知成分。我们将应用其他手段对这一部分化合物进行确定。本研究是定性分析海柳中含有何种挥发性成分，因而未能将15种化合物的标准品逐一进行绝对含量测定。

我们通过GC-MS鉴定的15种化学成分中，很多均有报道其详细的生物活性。例如：磷酸三乙酯(triethyl phosphate)很早就被证实有多方面的药理活性。它能够降低血压，松弛平滑肌、抑制心脏功能，且有轻微抗胆碱酯酶活性[11]。角鲨烯(squalene)能够提高体内超氧化物歧化酶(SOD)活性、增强机体免疫能力，抗衰老、抗疲劳及抗肿瘤作用。其次在疾病治疗方面，角鲨烯还作为一种辅药使用，能够直接或间接的对癌症化疗起到保护作用[12]。具有心血管活性的雪松醇(cedrol)，能够降低血压减慢心率，增强副交感神经作用。再加上它的舒缓作用可以缓解慢性心脏病[13]。丁羟甲苯(butylated hydroxytoluene， BHT)已作为抗氧化的食品添加剂。尽管一些报道指出BHT有潜在的毒性，但Williams等[14]认为现有食品添加剂的含量没有致癌的危险性，且在浓度低于100 μg/ml 时仍能起到抗癌的作用。含有羟基官能团的物质，尤其是酚类物质能够破坏细菌的细胞壁具有抗菌活性，如：棕榈酸(n-hexadecanoic acid)、苯酚(phenol)等。在鉴定的物质中还包括很多与抗氧化作用有着十分密切关系的酚酸类成分，海柳这些活性成分能否平衡吸烟过程中产生的大量自由基，减轻氧化损害和致癌性，有待进一步研究。

综上，本文首次揭示了海柳挥发性成分中所含有的一些活性物质，结合这些成分生物活性的相关报道，提示，海柳这种海洋生物材料的功效与这些活性成分有关，值得进一步研究海柳挥发性成分的药理活性。海洋生物物种及其所含活性物质的多样性和特异性已为天然药物开发开拓出广阔的前景。因此，研究开发潮汕地区所特有、民间应用有效的海洋资源尤为重要。

 

参考文献

[1]  Goldberg WM. Chemistry and structure of skeletal growth rings in the black coral Antipathes fiordensis (Cnidaria， Antipatharia) [J].  Hydrobiologia，1991，216/217 (1)：  403-409.

[2]  管华诗，王曙光.  中华海洋本草[M].  上海：上海科学技术出版社，2009：46-47.

[3]  Aiello A，Fattorusso E，Menna M. Five new polar sterols from the black coral Antipathes subpinnata[J]. Steroids，1991， 56 (10)：513-517.

[4]  Aiello A，Fattorusso E，Menna M. Four new bioactive polyhydroxylated sterols from the black coral Antipathes subpinnata[J].  J Nat Prod，1992，55 (3)：321-325.

[5]  Qi SH，Su GC，Wang YF. Alkaloids from the South China Sea black coral Antipathes dichotoma[J]. Chem Pharm Bull： Tokyo，2009，57 (1)：87-88.

[6]  苏国琛，张   偲，漆淑华.  黑角珊瑚的化学成分研究[J].  中草药，2008，39 (11)：1606-1609.

[7]  葛洁虹，高程海，王   萍，等.  南海二叉黑角珊瑚化学成分研究[J]. 中药材，2010，33 (9)：1403-1405.

[8]  肖宗苗，王仁镇，李文旭.  黑角珊瑚治疗骨伤疾病的临床观察[J]. 海南医学院学报，2005，2：135.

[9]  Pourmortazavi SM，Hajimirsadeghi SS.  Supercritical fluid extraction in plant essential and volatile oil analysis[J].  J Chromatogr A， 2007，1163 (1/2)：2-24.

[10] Zhao CX，Liang YZ，Fang HZ，et al.  Temperature-programmed retention indices for gas chromatography-mass spectroscopy analysis of plant essential oils[J].  J Chromatogr A，2005，1096 (1/2)：76-85.

[11] Gumbmann MR，Williams SN. Anticholinesterase activity of triethyl phosphate resulting from an impurity[J]. J Agric Food Chem，1970，18 (1)：76-77.

[12] Reddy LH，Couvreur P. Squalene：a natural triterpene for use in disease management and therapy[J]. Adv Drug Delivery Rev，2009，61 (15)：1412-1426.

[13] Dayawansa S，Umeno K，Takakura H，et al.  Autonomic responses during inhalation of natural fragrance of Cedrol in humans[J].  Auton Neurosci，2003，108 (1/2)：79-86.

[14] Williams GM，Iatropoulos MJ，Whysner J.  Safety assessment of butylated hydroxyanisole and butylated hydroxytoluene as antioxidant food additives[J]. Food Chem Toxicol，1999， 37 (9/10)：1027-1038.

 

收稿日期： 2011-03-03；修订日期：2011-04-12

基金项目： 国家自然科学基金项目 (30973922)，广东省自然科学基金团队项目 (9351503102000001)，广东省科技计划项目 (2008B030301240， 2010B030700043)，广东省中医药局项目 (2008162，2010408)

作者简介： 白雪婷 (1984-   )，女，山西太原人，硕士，研究方向：药理学。

*Correspondence to：SHI Gang-gang ，E-mail：ggshi@stu.edu.cn

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