苯并(a)芘和滴滴涕联合暴露对小鼠肝脏细胞凋亡的影响

 

赵   苒/郭向宇/王   娟/苏艳华/郑   芳/范   春*

(厦门大学医学院预防医学系，福建  厦门  361005)

 

Effects of benzo(a)pyrene and chlorophenothane exposure on apoptosis of liver cells in mice

 

ZHAO Ran，GUO Xiang-yu，WANG Juan，SU Yan-hua，ZHENG Fang，FAN Chun *

(Department of Preventive Medicine, Medical College, Xiamen University, Xiamen 361005, Fujian, China)

 

【摘要】 目的： 探讨不同剂量苯并(a)芘[benzo(a)pyrene， B(a)P]、滴滴涕(chlorophenothane， DDT)单独及联合暴露对小鼠肝脏细胞的毒性效应。 方法： 成年雌性昆明种小鼠66只，随机分为11组：分别为0.5、5、50 mg/(kg·d) B(a)P染毒组，0.025、0.25、2.5 mg/(kg·d) DDT染毒组，0.5 mg/(kg·d) B(a)P + 0.025 mg/(kg·d) DDT联合染毒组，5 mg/(kg·d) B(a)P + 0.25 mg/(kg·d) DDT联合染毒组，50 mg/(kg·d) B(a)P + 2.5 mg/(kg·d) DDT联合染毒组，空白对照组(正常饲养)和溶剂对照组(植物油处理)。染毒组用含B(a)P、DDT的食用油进行腹腔注射，每天1次，连续21 d，于末次给药24 h后处死小鼠。取肝脏制作冰冻切片，利用原位缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling， TUNEL)法检测肝细胞凋亡情况。 结果： 5和50 mg/(kg·d) B(a)P染毒组小鼠肝脏细胞凋亡率显著高于对照组 (P<0.05)，且50 mg/(kg·d)剂量组显著高于0.5和5 mg/(kg·d)剂量组(P<0.05)；各DDT染毒组与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；各浓度联合染毒组小鼠肝脏细胞凋亡率均高于对照组(P<0.01)，各联合染毒组细胞凋亡率间的差异无统计学意义(P>0.05)，联合染毒组细胞凋亡率和相应的B(a)P染毒组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论： B(a)P的单独暴露以及与DDT的联合暴露均可导致小鼠肝脏细胞凋亡的发生，并可能引发其他毒性效应。

【关键词】苯并(a)芘； 滴滴涕； 联合暴露； 肝细胞凋亡

 中图分类号： R994.6      文献标识码： A      文章编号： 1004-616X(2011)03-0194-05      doi: 10.3969/j.issn.1004-616x.2011.03.008

【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To study the effects of benzo(a)pyrene [B(a)P] and chlorophenothane(DDT) exposure alone or in combination on apoptosis of liver cells in mice. METHODS： 66 healthy female Kunming mice were randomly divided into 11 groups： 0.5， 5， 50 mg/(kg·d) B(a)P groups; 0.025， 0.25， 2.5 mg/(kg·d) DDT groups;0.5 mg/(kg·d) B(a)P + 0.025 mg/(kg·d) DDT group; 5 mg/(kg·d) B(a)P + 0.25 mg/(kg·d) DDT group; 50 mg/(kg·d) B(a)P + 2.5 mg/(kg·d) DDT group; blank control group (normal feed) and solvent control group(equal volume of oil). Exposure groups were injected with oil containing B(a)P and DDT once a day. After 21-day intraperitoneal injection， livers were taken for frozen sections. Apoptosis of liver cells was examined by TUNEL method. RESULTS：The apoptotic rates of 5 and 50 mg/(kg·d) B(a)P group were significantly higher than that of the control groups (P<0.01 or P<0.05)， besides the apoptotic rate of the 50 mg/(kg·d) B(a)P group was higher than that of the 0.5 and 5 mg/(kg·d) B(a)P groups (P<0.05). The apoptotic rates of the DDT groups had no significant difference with the control groups (P>0.05). In the combined exposure groups， apoptosis was more serious than that of the control groups (P<0.01)， while the comparison between the combined exposure groups showed no statistical difference(P > 0.05)， same with the combined groups and the corresponding B(a)P groups(P > 0.05). CONCLUSION：In these experimental conditions， 5 and 50 mg/(kg·d) B(a)P groups could cause liver cell apoptosis， and the higher the dose of B(a)P， the higher the apoptotic rate. No apoptosis could be demonstrated in 0.025， 0.25， 2.5 mg/(kg·d) DDT groups. All of the combined exposure groups could cause liver apoptosis， but there was no clear dose-response relationship observed. Above all， either B(a)P exposure alone or combined with DDT could cause liver cell apoptosis in mice. Whether it could cause other toxicological effects would be discussed in the future.

【KEY  WORDS】 benzo(a)pyrene；chlorophenothane；combined exposure；apoptosis of liver cells

 

多年监测结果显示，厦门海域的主要污染物是有机氯农药、多环芳烃、有机磷农药和部分重金属[1]。其中，多环芳烃、有机氯农药为持久性有机污染物(persistent organic pollutants， POPs)，可以通过食物链的生物富集作用在高级捕食者中成千上万倍地累积。随着工农业的发展，越来越多的污染物进入并共存于环境，其对机体的损害也常常是多因素联合作用的结果。1939年，Bliss提出研究两种毒物联合作用的毒性并首次提出了拮抗作用、加和作用、协同作用的划分，至此污染物的联合效应才逐渐为人们所认识。有关苯并(a)芘[benzo(a)pyrene， B(a)P]和三丁基锡(tri-n-butyltin， TBT)低浓度下长期混合暴露对北极嘉鱼影响的研究表明，TBT对B(a)P的生物激活有拮抗作用，而B(a)P强化了TBT的代谢[2-3]。因此，长期、低剂量暴露于环境中的混合污染物所致的损害效应研究更具现实意义。作为厦门海域的主要污染物，B(a)P和DDT的联合暴露对人群健康会产生何种影响，成为亟待解决的一个问题。为此，本项目选择小鼠肝脏细胞作为研究对象，通过模拟自然状态下B(a)P和DDT的污染水平进行单独和联合染毒，利用原位缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling， TUNEL)法检测肝细胞凋亡情况，以评价B(a)P和DDT对小鼠肝脏细胞的单独及联合毒性效应。

 

1  材料与方法

1.1  实验动物及分组

健康清洁级成年昆明种小鼠66只，雌性，体质量15.5～18.0 g，常规饲养。实验动物生产许可证号：SYXK(闽)2008-0001，实验动物使用许可证号：SYXK(闽)2008-0003。将动物随机分为以下11组，每组6只：分别为0.5、5、50 mg/(kg·d) B(a)P染毒组，0.025、0.25、2.5 mg/(kg·d) DDT染毒组，0.5 mg/(kg·d) B(a)P + 0.025 mg/(kg·d) DDT联合染毒组，5 mg/(kg·d) B(a)P + 0.25 mg/(kg·d) DDT联合染毒组，50 mg/(kg·d) B(a)P + 2.5 mg/(kg·d) DDT联合染毒组，空白对照组(正常饲养)和溶剂对照组(植物油处理)。依据参考文献[4]中指出的，环境中B(a)P和DDT的浓度比为20：1以及B(a)P经腹腔染毒LD50(500 mg/kg)确定各组暴露剂量，将配制好的各受试物按0.02 ml/g经腹腔注射染毒，每天1次，连续21 d，于末次给药24 h后处死动物。

1.2  主要试剂和仪器

B(a)P购自Alfa Aesar公司，纯度96%；DDT购自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，纯度98.5%；TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(冰冻切片)购自南京凯基生物科技有限公司；光学显微镜Olympus CM41(日本)；冰冻切片机Leica CM1900(德国)；低温恒温培养箱EYELA GI-700(日本)。

1.3  动物一般情况观察

动物染毒期间，每天称量体质量并观察一般情况，主要包括：饮食、大小便、皮毛、活动情况等。动物处死后，取肝脏肉眼观察质地、颜色等外观性状。

1.4  肝细胞凋亡检测

染毒结束后取小鼠肝组织制作冰冻切片。按TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(冰冻切片)提供的步骤进行TUNEL法检测细胞凋亡：切片先经4%多聚甲醛-PBS液室温下固定、3% H2O2-甲醇液室温封闭以及通透液室温下通透；每片加50 μl的TUNEL反应液，37 ℃孵育60 min； PBS冲洗后再加50 μl的S-HRP工作液，37 ℃孵育30 min；PBS冲洗后再加50 μl新鲜配制的DAB，室温孵育8 min；PBS冲洗后苏木素复染，乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照切片不加TdT酶反应液，阳性对照切片经DNaseⅠ预处理20 min，再按TUNEL步骤检测。整个操作过程于湿盒中进行，注意防止干片。

用光学显微镜对标本进行观察，细胞核内出现棕黄色即为凋亡(阳性)细胞。在光镜下对每张切片随机计数1 000个细胞中染色阳性的细胞数，按下式计算肝细胞凋亡率：

细胞凋亡率(%)=(阳性染色细胞数目/1 000)×100%

1.5  统计学方法

各组小鼠肝细胞凋亡率用-x ±s表示，采用SPSS 13.0统计软件对各组间均数差异的检验进行单因素方差分析，以α=0.05为检验水准。

 

2  结  果

2.1  动物一般情况

B(a)P处理组、DDT处理组和联合处理组(以下统称各处理组)动物体质量在染毒15 d后增长缓慢，活动性降低，个别动物体质量出现负增长。21 d染毒结束后，各处理组动物毛稀疏、竖立；B(a)P处理组和联合处理组动物的动作迟缓；解剖后见多数B(a)P处理组和联合处理组动物肝脏呈暗紫色。

2.2  各组动物肝脏细胞凋亡情况

2.2.1 阳性和阴性对照片  用空白对照组小鼠肝脏按TUNEL法制备阳性和阴性对照片，阳性对照片肝脏细胞凋亡率达99%以上，阴性对照片肝脏细胞凋亡率约为0.1%。见图1。

2.2.2  各处理组小鼠肝脏细胞凋亡情况  光学显微镜下见染毒组小鼠肝脏细胞排列紊乱，细胞之间空泡化，凋亡细胞散在分布，可见核固缩。各组肝脏细胞凋亡情况见图2。

2.2.3  各处理组小鼠肝脏细胞凋亡率比较  各处理组小鼠肝脏细胞凋亡率见表1，对各组间的差异进行统计学分析，结果显示：①空白对照组和溶剂对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，以下统称对照组；②DDT染毒组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)； ③5、50 mg/(kg·d) B(a)P染毒组小鼠肝脏细胞凋亡率高于对照组 (P<0.05、P<0.01)，且50 mg/(kg·d)剂量组与0.5和5 mg/(kg·d)剂量组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；④各浓度联合染毒组小鼠肝脏细胞凋亡率高于对照组(P<0.01)，联合染毒组之间比较差异无统计学意义(P >0.05)，联合染毒组细胞凋亡率和相应的B(a)P染毒组比较，差异无统计学意义(P >0.05)。

 

3  讨  论

肝脏是B(a)P和DDT代谢转化的主要器官，也是其毒作用的靶器官，而细胞是器官执行其功能的基本单位，细胞的状态直接关系到肝脏乃至机体的生理功能。细胞凋亡是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用，它并不是病理条件下自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。细胞凋亡受多因素调控，并参与调节机体许多病理生理过程。能够诱发细胞凋亡的因素很多，如射线、药物等，细胞凋亡在维持多细胞生物体发育和稳态方面起到重要作用。凋亡的紊乱参与了多种疾病的发生和发展，如癌症、神经退行性疾病和中毒性疾病等[5]。肝细胞是肝脏的基本功能单位，其损伤、凋亡可以导致肝硬化、肝癌等肝脏终末疾病。

本实验采用TUNEL法检测B(a)P和DDT诱导的小鼠肝脏细胞凋亡情况，观察到5和50 mg/(kg·d) B(a)P染毒可以引起肝脏细胞的凋亡，并且随着染毒剂量的增加，细胞的凋亡率增高。张晶等[6]对小鼠连续灌胃染毒3 d， 剂量为0，5、10、20、40 mg/(kg·d)，发现B(a)P可以诱导肝细胞凋亡，并随染毒剂量的增加凋亡率增高，这与本实验结果相仿。Gregoraszczuk等人[7] 用包含DDT及其代谢产物p，p’-DDE的POPs混合物(其中DDT 5 g/ml；p，p’-DDE 10 g/ml)对体外培养的猪卵泡膜和颗粒细胞进行持续48 h的染毒，观察细胞类固醇激素的分泌、细胞增殖和凋亡情况，发现POPs混合物并没有显著影响细胞存活率和细胞凋亡。但是，有关B(a)P和芘对梭鱼肝脏损伤的研究发现，二者对DNA损伤的联合作用大于分别作用之和，即为加强作用[8]。B(a)P和TBT低浓度下长期混合暴露对北极嘉鱼影响的研究表明，TBT对B(a)P的生物激活有拮抗作用，而B(a)P却强化TBT的代谢[2-3]。尽管本实验条件下并未观察到肝脏细胞凋亡率在不同浓度B(a)P和DDT联合染毒组之间以及同相应的B(a)P染毒组之间存在统计学差异，但仍显示了混合暴露对靶器官产生的毒性效应。

此外，有文献报道B(a)P也可诱导生殖细胞产生凋亡，对BALB/c小鼠皮下注射B(a)P 5周(剂量为每周0，0.5， 5，50 mg/kg)，每周0.5 mg/kg剂量就可以引起睾丸生殖细胞的凋亡，在5 mg/kg剂量凋亡达到高峰，随染毒剂量继续加大，凋亡率开始下降，生殖细胞死亡增加[9]。但金明华[10]对ICR小鼠灌胃染毒3和7 d[剂量0， 5，10，20，40 mg/(kg·d)]，结果发现在第3天10 mg/(kg·d)组小鼠睾丸生殖细胞凋亡率达到最高(约21.9%)，与对照组间差异具有统计学意义，随着染毒时间和剂量的继续增加，细胞凋亡率下降。本实验检测到的细胞凋亡率明显低于以上文献的报道，可能与随染毒时间和剂量的增加，肝脏细胞的变性、坏死及死亡增加有关。

TUNEL法是通过检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况来检测凋亡细胞的，B(a)P所致的肝脏DNA损伤虽然已在体内及体外实验中被观察到，但是鉴于细胞类型和染毒方法以及剂量的不同，B(a)P对细胞凋亡的影响可能有所不同，既可能存在剂量-反应关系，也可能存在剂量与反应的“时间窗”。其与DDT 等多种污染物之间的作用可能更加复杂，这种效应很可能会因污染物种类、混合暴露剂量以及暴露时间等因素的影响而呈现不同的变化，这有待我们在今后的研究中继续探索。

 

参考文献

[1]  李永玉，洪华生，王新红，等.  厦门海域有机磷农药污染现状与来源分析[J].  环境科学学报，2005，25(8)：1071-1077.

[2]  Padrós J， Pelletier E， Ribeiro CO.  Metabolic interactions between low doses of benzo[a]pyrene and tributyltin in arctic charr(Salvelinus alpinus)：a long-term in vivo study[J]. Toxicol Appl Pharmacol，2003，192(1)：45-55.

[3]  Padrós J， Pelletier E，Reader S， et al. Mutual in vivo interactions between benzo[a]pyrene and tributyltin in brook trout(Salvelinus fontinalis)[J]. Environ Toxicol Chem，2000，19(4)：1019-1027.

[4]  Richardson BJ，Mak E，De Luca-Abbott SB，et al. Antioxidant responses to polycyclic aromatic hydrocarbons and organochlorine pesticides in green-lipped mussels (Perna viridis)： do mussels “integrate” biomarker responses? [J].  Mar Pollut Bull， 2008， 57(6/12)：503-514.

[5]  Fadeel B， Orrenius Z， Zhivotovsky B. Apoptosis in human disease：a new skin for the old eremony[J]. Biochem Biophys Res Commun，1999，266(3)：699-717.

[6]  张   晶，金明华，刘晓梅，等.  苯并[a]芘对小鼠肝细胞凋亡的影响[J]. 中国公共卫生，2006，22(10)：1242-1243.

[7]  Gregoraszczuk EL，Ptak A， Karniewska M， et al.  Action of defined mixtures of PCBs， p，p'-DDT and its metabolite p，p'-DDE， on coculture of porcine theca and granulosa cells： steroid secretion， cell proliferation and apoptosis[J]. Reprod Toxicol，2008，26(2)：170-174.

[8]  陈奕欣，王重刚，李   钦，等.  苯并(a)芘和芘对梭鱼肝脏DNA损伤的研究[J].  海洋学报， 2000，22(2)：92-96.

[9]  Ariel R，Hila R，Younglai E，et al.  Resveratrol， a natural aryl hydrocarbon receptor antagonist， protects sperm from DNA damage and apoptosis caused by benzo(a)pyrene[J]. Reprod Toxicol， 2001， 15(5)：479-486.

[10] 金明华.  苯并(a)芘对小鼠睾丸细胞毒作用及其相关机制研究[D].  吉林：吉林大学公共卫生学院，2007：60-62.

 

收稿日期： 2010-12-16；修订日期：2011-01-26

基金项目： 厦门大学新世纪优秀人才支持计划(2005)，厦门大学医学院院长基金(2010)，厦门大学引进人才启动基金(2008)

作者简介： 赵   苒(1976－   )，女，山东省邹城人，讲师，博士，研究方向：环境有害因素的生物健康效应及机制。E－mail： zhaoran@xmu.edu.cn

*Correspondence to：FAN Chun，Tel：0592－2184155，E－mail： fanchun65@163.com

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