哈萨克族食管癌中MMP-1、MMP-2、MMP-7、TIMP-1 和MTA1的表达及其临床病理意义

 

李秀梅1/陈  艳1/王洪江2/庞作良2/李  卉1/姜孝芳1/古丽努尔·木哈依1/谌宏鸣1/李惠武1，*

( 1. 新疆医科大学基础医学院；2. 新疆医科大学附属肿瘤医院，新疆  乌鲁木齐  830011 )

 

The expression and significance of MMP-1,，MMP-2, MMP-7, TIMP-1 and MTA1 in esophageal cancer of Kazaks

 

LI Xiu-mei1，CHEN Yan1，WANG Hong-jiang2，PANG Zuo-liang2，LI Hui1，JIANG Xiao-fang1，Gulinuer·Muhayi1，CHEN Hong-ming1，LI Hui-wu1，*

(1. School of Basic Medicine; 2. The Affiliated Tumour Hospital,  Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang, China)

 

【摘要】 目的： 探讨在新疆哈萨克族食管癌组织中基质金属蛋白酶1、2、7 (MMP-1、MMP-2、MMP-7)、基质金属蛋白酶抑制因子1 (TIMP-1 )和肿瘤转移相关基因1 (MTA1) mRNA的表达及其临床意义。方法：采用RT-PCR方法检测75例哈萨克族食管癌标本中MMP-1、MMP-2、MMP-7、TIMP-1和MTA1 mRNA的表达水平，分析其表达与临床病理特征的关系。结果：MMP-1、MMP-2、MMP-7、TIMP-1和MTA1 mRNA在哈萨克族食管癌组织中的表达较正常组织增高，差异均具有统计学意义 (P均<0.05)；且MMP-2、MMP-7、MTA1 mRNA的表达与淋巴结转移有关 (P<0.05)，MMP-1、MMP-7 mRNA的表达与临床分期有关 (P<0.05)；TIMP-1与MMP-1、MMP-7、MTA1的表达呈正相关 ( r =0. 446、0. 458、0. 333，P均<0.01)。 结论：MMP-1、MMP-2、MMP-7、TIMP-1和MTA1 mRNA表达上调共同参与了哈萨克族食管癌的发生发展过程；MMP-2、MMP-7和MTA1可能是哈萨克族食管癌发生侵袭、转移的主导因素。

【关键词】 食管癌；基质金属蛋白酶；基质金属蛋白酶抑制因子1；肿瘤转移相关基因1

 中图分类号： R734.2      文献标识码： A      文章编号： 1004-616X(2011)03-0190-05      doi: 10.3969/j.issn.1004-616x.2011.03.007

【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To study expressions of matrix metalloproteinase1，2，7 ( MMP-1，MMP-2，MMP-7)，tissue inhibitor of matrix metallo proteinase 1(TIMP-1) and metastasis associated gene 1 (MTA1)in esophageal cancer tissue and normal tissue among Kazaks and to investigate the relationship between their expressions and clinical pathological features. METHODS：Using RT-PCR to detect the expressions of MMP-1，MMP-2，MMP-7，TIMP-1 and MTA1 in 75 esophageal cancer specimens. RESULTS：The mRNA expressions of MMP-1，MMP-2，MMP-7 ，TIMP-1 and MTA1 in cancer tissue were higher than those of normal tissues(P＜0.05)．While the expression levels of MMP-2，MMP-7 and MTA1 mRNA were significantly related to the lymph node metastasis.  The expression levels of MMP-1，MMP-7 mRNA were significantly related to the TNM stages(P＜0.05)． The expression of TIMP-1 in the Kazak's esophageal cancer was positively related to the expressions of MMP-1，MMP-7，MTA1 ( r = 0.446、0.458、0.333，respectively， P<0.01 )． CONCLUSION：The overexpressions of MMP-1，MMP-2，MMP-7，TIMP-1 and MTA1 gene could have important roles in carcinogenesis of esophageal cancer in the Kazaks. Their synergistic effect could promote carcinogenesis and development of esophageal cancer. The MMP-2，MMP-7 and MTA1 genes may be the main players of progression and metastasis in esophageal cancer among Kazaks．

【KEY  WORDS】 esophageal cancer；matrix metalloproteinase；tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1； metastasis associated gene 1

 

食管癌是世界上6大常见恶性肿瘤之一，目前仍是引起人类死亡的主要原因之一[1]。食管癌患病率因地区变化而显著不同，新疆是个多民族地区，居住着哈萨克族、蒙古族、维吾尔族等13个少数民族，其中哈萨克族食管癌发病率最高 (155.9/10万)，高于同地区其他民族 (22.3/10万)，比全国平均病死率高2.3倍[2]。这提示我们深入研究民族遗传背景的差异或基因多态性与肿瘤发生发展的关系，对肿瘤发病机制的阐明和肿瘤的诊断与治疗具有重要意义。基质金属蛋白酶(matrix metallo proteinase， MMPs)是一类结构具有同源性、依赖Zn2+的蛋白酶家族，可以降解、重塑细胞外基质，在细胞迁移、生长、凋亡、分化及侵入等方面发挥重要作用。基质金属蛋白酶抑制因子1(tissue inhibitor of matrix metallo proteinase 1，TIMP-1)是MMPs特异性的抑制物，两者的表达及代谢失衡与肿瘤的侵袭、转移和临床预后有密切关系[3-4]。肿瘤转移相关基因1(metastasis associated gene 1，MTA1)是近年来发现的一个与肿瘤转移关系密切的基因[5]。MMP-1、MMP-2、MMP-7、TIMP-1和MTA1是与恶性肿瘤的侵袭、转移和预后不良密切相关的转录因子，但其在哈萨克族食管癌组织中的研究报道较少。因此，我们采用RT-PCR方法检测75例新疆哈萨克族食管癌组织及其远端癌旁正常组织中MMP-1、MMP-2、MMP-7、TIMP-1 和MTA1基因的表达，并结合临床病理资料，分析它们的表达与哈萨克族食管癌临床病理学行为的关系及意义。

 

1  材料与方法

1.1  临床资料

75例新疆哈萨克族食管癌组织及远端正常组织标本均取自2008~2010年新疆医科大学附属肿瘤医院手术切除病例，患者术前均未接受放化疗，术中取材后迅速将标本置于液氮中，于-80 ℃冰箱保存。病理切片均诊断为鳞状上皮细胞癌。按2009年国际TNM分期(UICC)标准，其中I期12例，Ⅱ期23例，Ⅲ期40例；有淋巴结转移48例，无淋巴结转移27例。

1. 2  引物与试剂

PCR试剂盒(上海生工)，PCR扩增引物由上海生物工程有限公司合成；RNA提取试剂Trizol (Invitrogen公司)； 逆转录试剂盒 (Promega公司 )；引物的设计根据Genbank的基因序列、用Primer5. 0软件设计，见表1。

1.3  组织总RNA提取及RT-PCR

采用一步法提取总RNA，按Trizol试剂说明书操作。紫外分光光度计测定其纯度。以提取的总RNA为模板，按逆转录试剂盒说明书进行逆转录。以得到的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增反应体积为20 μl，反应条件：94 ℃ 5 min预变性；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃1 min，35个循环；72 ℃ 5 min，扩增反应结束后进行2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪对条带进行灰度扫描。以GAPDH为内参照，每个样本重复2次。

1.4  统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件包进行分析，各基因表达量的比较采用 t 检验；与临床病理因素关系的比较采用χ2检验，Spearman分析各基因相关性，以α=0.05 为检验水准。

 

2  结  果

2.1  MMP-1、MMP-2、MMP-7、TIMP-1和MTA1 mRNA的表达

经光密度分析，MMP-1、MMP-2、MMP-7、TIMP-1 和MTA1 mRNA在食管癌组织和癌旁正常组织中的表达水平见表2和图1，与癌旁正常组织相比，MMP-1、MMP-2、MMP-7、TIMP-1和MTA1 mRNA在食管癌组织中的表达均上调，差异均有统计学意义(P均<0. 05)。

 

2.2   哈萨克族食管癌组织中MMP-1、MMP-2、MMP-7、TIMP-1和MTA1 mRNA的表达与病理因素的关系

MMP-2、MMP-7和MTA1 mRNA的表达与淋巴结转移有关 (P<0.05)，MMP-1、MMP-7 mRNA的表达与临床分期有关 (P<0.05)；TIMP-1 mRNA的表达与分化程度、淋巴结转移、临床分期均无明显相关关系 (P>0.05)，见表3。

2.3  基因相关性分析

Spearman相关分析显示在哈萨克族食管癌组织中MTA1与MMP-2、MMP-7的表达呈正相关 ( r =0.52、 0.594，P均<0.05)，MMP-2与MMP-7的表达也呈正相关 ( r =0.312，P<0.05)。TIMP-1与MMP-1、MMP-7、MTA1的表达相关 ( r =0.446、 0.458、0.333，P<0.01)， TIMP-1与MMP-2的表达无明显相关关系 ( r =0.156， P>0.05)。随着临床分期的进展，与Ⅰ～Ⅱ期相比，Ⅲ～Ⅳ期时癌旁正常对照组织中TIMP-1/MMP-1， TIMP-1/MMP-7的比值上升，而在癌组织中TIMP-1/ MMP-1，TIMP-1/MMP-7的比值降低，差异均有统计学意义 (P均<0.05)，而相应癌组织和癌旁正常组织比较，仅Ⅲ～Ⅳ期TIMP-1/MMP-7的比值在两者间的差异有统计学意义 (P<0.05)。见表4。

 

3  讨  论

肿瘤的侵袭转移是一个多因素参与的复杂过程，而现在认为在肿瘤的侵袭性生长过程中基质金属蛋白酶 (MMPs)发挥了关键作用，MMPs是一组由纤维母细胞、中性粒细胞、巨噬细胞及肿瘤细胞分泌的，依赖Zn2+的蛋白酶家族，其结构具有同源性，目前在人类已发现有19种。MMPs在人体组织内分布很广，具有广泛及多样的功能，除了降解、重塑细胞外基质，还可调节细胞-细胞及细胞-基质间的信号，在细胞迁移、生长、凋亡、分化及侵入等方面发挥重要作用[6]，在肿瘤的发生发展过程中MMPs降解细胞外基质成分，调控肿瘤新生血管形成，影响细胞黏附分子的功能以及肿瘤细胞的生长[7-8]。基质金属蛋白酶抑制因子(TIMPs)是一类多基因家族的编码蛋白，是MMPs的天然抑制剂，目前已知的TIMPs主要有4种，分别为TIMP-1 ～ TIMP-4。MMPs和TIMPs之间存在一定程度的特异性，TIMP-1能抑制大多数MMPs[9]。MTA1是新近发现的一个肿瘤浸润转移候选基因，它通过促进组蛋白脱乙酰基，影响基因的转录和复制，与多种肿瘤组织，尤其是上皮源性恶性肿瘤组织的侵袭转移能力密切相关。MTA1表达的增高与多种上皮性恶性肿瘤的侵袭和转移能力呈正相关[10]。

本研究应用半定量RT-PCR方法检测75例哈萨克族食管癌组织和远端癌旁正常对照组织中MMP-1、MMP-2、MMP-7、TIMP-1和MTA1 mRNA的表达情况，结果显示它们在癌组织中的表达均显著高于癌旁正常对照组织，MMP-2、MMP-7和MTA1 mRNA的表达与淋巴结转移有关，有淋巴结转移的癌组织中MMP-2、MMP-7和MTA1的阳性表达率均显著高于无淋巴结转移的组织，提示MMP-1、MMP-2、MMP-7和MTA1表达上调共同参与了哈萨克族食管癌的发生发展过程，MMP-2、MMP-7和MTA1可能是哈萨克族食管癌发生侵袭、转移的主导因素。MMP-2过度表达分解细胞外基质，使肿瘤向深层浸润并突破血管和淋巴管，促进血管生成，造成血行和淋巴转移。MMP-7在肿瘤细胞高表达，不仅可以激活MMPs家族中其它成员，而且降解基底膜。MTA1参与肿瘤侵袭转移的机制仍不清楚，有研究表明，MTA1蛋白能与组蛋白去乙酰化酶(HDACs)结合，募集HDACs到目标基因的启动子区域，可以直接或者间接作用于某些抑制肿瘤浸润转移的基因，下调其转录[11]。Hofer等[12]的研究发现，MTA1可以显著改变细胞角蛋白丝系统的组装及细胞骨架蛋白的定位，并使细胞获得更具有浸润性和转移性的表型。Spearman相关分析显示MTA1与MMP-2、MMP-7的表达呈明显正相关 ( r =0.52、0.594，P均<0.05)，MMP-2与MMP-7的表达也呈正相关 ( r =0.312， P<0.05)，说明在哈萨克族食管癌中MMP-2、MMP-7和MTA1表达上调可能共同促进了食管癌的转移。

在本次试验中我们发现TIMP-1在哈萨克族食管癌组织中表达上调，但TIMP-1 mRNA表达与肿瘤分化、转移及临床分期均无明显相关关系。而TIMP-1与MMP-1、 MMP-7表达呈正相关 ( r =0.446、0.458，P均<0.01)， 这提示在哈萨克族食管癌发病过程中，随着MMP-1、MMP-7表达上调，表达上调的TIMP-1可能发挥保护作用即抑制肿瘤细胞的侵袭和转移[13]。由于MMP-1、MMP-7 mRNA的表达与临床分期有关，故在实验中我们检测了TIMP-1/MMP-1、TIMP-1/MMP-7比值在临床分期中的变化，发现Ⅲ～Ⅳ期食管癌组织中TIMP-1/ MMP-1、TIMP-1/MMP-7的比值明显低于Ⅰ～Ⅱ期，这表明随着肿瘤的恶性发展，TIMP1相对于MMPs的分泌严重不足，TIMP1/MMPs平衡状态被打破，MMPs的作用明显增强，导致肿瘤的高侵袭性。

综上所述，MMP-1、MMP-2、MMP-7、TIMP-1和MTA1基因表达上调在哈萨克族食管癌的发生发展过程中发挥协同作用，随着病程进展，TIMP1/MMPs平衡状态被打破，MMP-2、MMP-7和MTA1可能是哈萨克族食管癌发生侵袭、转移的主导因素，MMP-2、MMP-7和MTA1的联合检测可评价食管癌的恶性程度及预后。

 

参考文献

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收稿日期： 2011-03-06；修订日期：2011-03-24

基金项目： 国家自然科学基金项目 (30950012)

作者简介： 李秀梅 (1973-   )，女，山东人，实验师，博士研究生，研究方向：肿瘤分子生物学。Tel：13899818077；E-mail：dr.lxm@163.com

*Correspondence to：LI Hui-wu，E-mail：huiwuli1234@163.com

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