Zwint-1及其变异体Zwint-1v在HeLa细胞不同细胞周期中的亚定位

 

张   驰/李   蕊#/李康生*

( 汕头大学医学院，广东  汕头  515041 )

 

The sub-localization of Zwint-1 and Zwint-1v in different cell cycles of HeLa cells

 

ZHANG Chi，LI Rui #，LI Kang-sheng*

(Shantou University Medical College, Shantou 515041, Guangdong, China)

 

【摘要】 目的： 探讨Zw10结合因子-1 (zeste white 10 interactor-1，Zwint-1) 及其变异体 (Zwint-1v)在HeLa细胞不同细胞周期中的亚定位。方法：采用胸腺嘧啶核苷双阻断法将HeLa细胞同步化，通过瞬时转染及间接免疫荧光检测，观察Zwint-1及Zwint-1v在HeLa细胞不同细胞周期中的亚定位。结果：在HeLa细胞间期，Zwint-1野生型定位于细胞质，而Zwint-1v定位于细胞核；在分裂期，Zwint-1野生型及Zwint-1v定位于纺锤体与着丝粒上。Zwint-1v定位较野生型更趋近于细胞核。结论： Zwint-1及Zwint-1v在HeLa细胞不同细胞周期的亚定位存在差异。

【关键词】 Zwint-1；HeLa细胞；有丝分裂检查站；亚定位

 中图分类号： R73；Q319     文献标识码： A     文章编号： 1004-616X(2011)03-0186-04     doi: 10.3969/j.issn.1004-616x.2011.03.006

【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To study the sub-localization of Zwint-1 wild type and variant(Zwint-1v) in different cell cycles of HeLa cells. METHODS：HeLa cells were synchronized using thymidine double-block method. The sub-localization of Zwint-1 wild type and Zwint-1v were identified by fluorescence microscope after transfection and indirect immunofluorescence. RESULTS：In interphase of HeLa cells，Zwint-1 wild type was localized in the cytoplasm， while Zwint-1v were in nucleus. In mitotic phase，Zwint-1 wild type and Zwint-1v were found on the spindle and centromere. Zwint-1v was closer to the nucleus than the wild type.  CONCLUSION：Zwint-1 wild type and Zwint-1v during cell cycle have different sub-localization.

【KEY  WORDS】 Zwint-1；Zwint-1v；mitotic checkpoint；localization

 

真核细胞有丝分裂过程中，有丝分裂检查站的功能是保证染色体均等的分配到子细胞中，防止细胞产生染色体非整倍体。Zw10 (zeste white 10)是有丝分裂检查站的关键蛋白之一，主要分布于着丝粒、纺锤体或细胞质中，在不同的细胞周期定位不同。细胞一旦缺失Zw10，则有丝分裂不能正常的进行[1]。Zwint-1 由Zwint基因编码，全长278个氨基酸，其N端可与Zw10结合，在细胞周期中共同发挥有丝分裂检查站的作用 [2]。缺失Zwint-1不会使细胞有丝分裂停止，却可造成染色体过早的分离[2-3]。有文献报道，Zwint-1与多种癌症、罗伯茨综合征等有关[4]。本实验室的前期研究发现存在新的Zwint-1变异体 (Zwint-1v)，其蛋白N端有208个氨基酸与Zwint-1保持一致 (待发表)。

本次实验通过构建融合Flag、强化绿色荧光蛋白 (enhanced green fluorescence protein，EGFP)标签真核表达质粒，利用细胞周期同步化技术使HeLa细胞分别处于间期与分裂期，分析HeLa细胞不同细胞周期中Zwint-1及Zwint-1v蛋白的定位，研究真核细胞有丝分裂中，Zwint-1及Zwint-1v随细胞周期的变化情况。着丝粒蛋白A (centromere proteins-A，CENP-A)是重要的类组蛋白，可以大致定位着丝粒，在整个细胞中均有分布。本实验中的CENP-A主要在Zwint-1野生型及变异体对比中起对照作用。

 

1  材料与方法

1.1  细胞及主要试剂

HeLa细胞为本实验室保存，DMEM培养基、0.25%胰酶、SuperScript Ⅲ RTase、Lipofectamine 2000 均购自Invitrogen公司，小鼠抗Flag单抗、胸腺嘧啶核苷 (thymidine，TdR)、诺考达唑 ( Nocodazole)均购自Sigma 公司。兔抗着丝粒蛋白CENP-A抗体、Cy3标记羊抗小鼠二抗，Cy3标记羊抗兔二抗及Hoeschst33258 均购自碧云天生物公司。 Kpn I、Bam HI及T4 DNA连接酶均购自北京NEB公司。Zwint-1及Zwint-1v融合Flag标签真核表达质粒 pcFlag-Zwint-1、pcFlag-Zwint-1v为本室保存。

1.2  pEGFP-Zwint-1v融合表达质粒的构建

以pcFlag-Zwint-1v为模板，使用上游引物5' -AGAGGTACCATGGAGGCAGCGGAGACAGAG-3' 和下游5' -GAAGGATCCTTACATCTCCAGCAGGTTGTAG-3' 进行PCR扩增，PCR产物回收后用Kpn I和BamHI双酶切，插入pEGFP-C1 (美国Clontech公司)载体的相应位点。酶切鉴定和DNA测序检测确定插入序列，构建Zwint-1v的EGFP融合表达质粒pEGFP-Zwint-1v。

1.3  HeLa细胞培养及瞬时转染

HeLa细胞于含10%小牛血清的DMEM培养基中，37 ℃、5% CO2条件下常规培养。取HeLa细胞接种于6孔培养板中，密度为每孔0.5×105个细胞，加入洁净的盖玻片，37 ℃、5% CO2温箱培养24 h。待细胞爬片生长至80%~90%融合率时，用Lipofectamine 2000进行瞬时转染，分别单转染pcFlag-Zwint-1v质粒，及共转染pEGFP-Zwint-1v质粒和 pcFlag-Zwint-1质粒。

1.4  HeLa细胞周期同步化

采用胸腺嘧啶核苷双阻断法对HeLa细胞进行同步化处理。间期同步化：在对数生长期的HeLa 细胞6孔板中加入终浓度为2.5 mmol/L TdR，干预18 h后去掉TdR，PBS洗2遍，加入新鲜DMEM培养 9 h进行释放，再用含2.5 mmol/L TdR的DMEM干预12 h；撤除TdR，换新鲜DMEM继续培养2 h。分裂期同步化：终浓度2.5 mmol/L 的TdR培养处理，干预18 h后去掉TdR，PBS洗2遍，新鲜DMEM培养3 h释放；再用终浓度为100 ng/ml的Nocodazole的DMEM干预12 h；撤除Nocodazole，换新鲜培养基。

1.5  间接免疫荧光及细胞核染色

1.5.1  Flag融合标签表达质粒的转染  HeLa细胞用PBS洗3遍，4%多聚甲醛室温固定3 min。含有0.2% Triton X-100和0.04% SDS的PBS室温穿透3 min，PBS洗3遍，加入1∶1 000稀释的小鼠抗Flag单抗室温孵育60 min，PBS洗3遍，加入 (1∶500)Cy3标记的羊抗小鼠二抗继续孵育45 min，用PBS洗3遍。

1.5.2  pEGFP-Zwint-1v的转染  HeLa细胞以同上方法进行转染。一抗为兔抗CENP-A抗体，二抗为Cy3标记羊抗兔二抗。

1.5.3  核染色  转染后细胞用Hoechst33258进行核染色。之后在荧光显微镜下观察带有融合标签的Zwint-1及Zwint-1v在HeLa细胞中不同细胞周期的亚定位。

 

2  结  果

2.1  融合表达质粒pEGFP-Zwint-1v的构建与鉴定

以pcFlag-Zwint-1v为模板PCR扩增得到了Zwint-1v片段，大小为804 bp，与预期相符 (图1A)。PCR产物经Kpn I和BamHI双酶切插入pEGFP-C1相应位点得到重组质粒，分别利用Kpn I和BamHI双酶切、HindIII和BamHI双酶切鉴定，可切出外源片段 (图1B)。质粒经DNA测序，序列与设计相符 (测序结果略)。得到Zwint-1v的EGFP 融合表达质粒pEGFP-Zwint-1v。

2.2  Zwint-1v在HeLa细胞不同细胞周期的亚定位(Flag标签)

转染pcFlag-Zwint-1v的间期HeLa细胞中，仍然可以模糊的看到核仁的存在，Zwint-1v (红色)主要以弥散分布或呈点状结构分布于胞核内。转染pcFlag-Zwint-1v的中期HeLa细胞中，核膜核仁消失，形成纺锤体，细胞核呈球形，Zwint-1v主要以弥散分布或呈点状结构分布于细胞纺锤体。转染pcFlag-Zwint-1v的后期HeLa细胞，由于纺锤体微管的活动，着丝点纵裂，每一染色体的两个染色单体分开，并向相反方向移动，接近各自的中心体，染色单体遂分为两组；细胞被拉长，并由于赤道部细胞膜下方环行微丝束的活动，该部缩窄，细胞遂呈哑铃形。 Zwint-1v主要以弥散分布或呈点状结构分布于细胞纺锤体及着丝粒 (图2)。

 

2.3  Zwint-1v在HeLa细胞不同细胞周期的亚定位(EGFP标签)

转染pcEGFP-Zwint-1v的间期HeLa细胞中，可以清晰看到核仁的存在，Zwint-1v (绿色)主要以弥散分布或呈点状结构分布于胞质内；CENP-A (红色)作为着丝粒蛋白标记染色体着丝粒位置，主要分布于细胞核。转染pcEGFP-Zwint-1v的中、后期HeLa细胞中，核膜核仁消失，形成纺锤体，细胞呈哑铃状，已基本形成两个细胞型；Zwint-1v (绿色)主要以弥散分布或呈点状结构分布于细胞纺锤体；着丝粒蛋白CENP-A (红色)弥散分布于整个细胞中 (图3)。

 

2.4  野生型Zwint-1及变异体Zwint-1v在HeLa细胞不同细胞周期的亚定位

共转染pcFlag-Zwint-1及pcEGFP-Zwint-1v的间期HeLa细胞中：核仁仍存在，Zwint-1野生型 (红色)主要分布于细胞质中；Zwint-1v (绿色)大部分位于细胞核内及细胞质靠近细胞核部位。共转染pcFlag-Zwint-1及pcEGFP-Zwint-1v的中期HeLa细胞中：核膜核仁消失，形成纺锤体，细胞呈哑铃状。Zwint-1野生型主要以分散于细胞质及纺锤体中；Zwint-1v主要分布于细胞纺锤体及着丝粒 (图4)。

3  讨  论

异常的有丝分裂是导致细胞癌变、畸变、突变的关键原因之一。Zwint-1蛋白是有丝分裂中关键且不可缺少的检查站蛋白，主要定位于染色体的着丝粒上，并随着细胞周期的变化而变化[2，5]。但其变异体Zwint-1v是否有相同的转位规律还未见有关报道。为此，我们进行了Zwint-1及其变异体Zwint-1v在HeLa细胞不同细胞周期中亚定位的研究。

需要说明的是，本文中的Zwint-1v是本实验室发现的一个新变异体，与野生型Zwint-1 (NM_007057.3) 对比，该选择性转录本在开放读码框架(ORF)的第624位至第661位碱基发生了37 bp的缺失，导致随后出现了移码突变。该选择性转录本编码260个氨基酸残基，其中N端有208个氨基酸与野生型一致，而在C端的52个氨基酸不同。且本次试验中真核表达质粒pc-Flag是在pcDNA 3基础上改造的，在pcDNA3的CMV启动子和多克隆位点之间加入了Kozak序列和Flag标签，插入该载体多克隆位点的基因片段可表达N端含有Flag标签的重组蛋白。

通过真核细胞标签蛋白融合表达及间接免疫荧光，我们发现间期HeLa细胞，Zwint-1野生型定位于细胞质，Zwint-1v主要定位于细胞核[6]；在细胞分裂中后期，Zwint-1及Zwint-1v大部分转移到细胞核的纺锤体及着丝粒上，但Zwint-1v比野生型更趋近于细胞核；而在末期回到细胞质中[1-2]。

实验结果表明Zwint-1v与Zwint-1的定位并不完全一致，可以看出变异体较之野生型更向细胞核内聚集。

 

参考文献

[1]  Kops GJ，Kim Y，Weaver BA，et al.  ZW10 links mitotic checkpoint signaling to the structural kinetochore[J]. J Cell Biol，2005，169 (1)：49-60.

[2]  Wang H，Hu X，Ding X，et al. Human Zwint-1 specifies localization of Zeste White 10 to kinetochores and is essential for mitotic checkpoint signaling[J]. J Biol Chem，2004，279 (52)：54590-54598.

[3]  Lin YT，Chen Y，Wu G，et al.  Hec1 sequentially recruits Zwint-1 and ZW10 to kinetochores for faithful chromosome segregation and spindle checkpoint control[J]. Oncogene， 2006，25 (52)：6901-6914.

[4]  Musio A，Mariani T，Montagna C，et al. Recapitulation of the Roberts syndrome cellular phenotype by inhibition of INCENP，ZWINT-1 and ZW10 genes[J]. Gene，2004，331 ：33-40.

[5]  Obuse C，Iwasaki O，Kiyomitsu T，et al. A conserved Mis12 centromere complex is linked to heterochromatic HP1 and outer kinetochore protein Zwint-1[J]. Nat Cell Biol，2004，6 (11)：1135-1141.

[6]  Sekulic N，Bassett EA，Rogers DJ，et al.  The structure of  (CENP-A-H4)(2) reveals physical features that mark centromeres[J]. Nature，2010，467 (7313)：347-351.

 

收稿日期： 2011-03-22；修订日期：2011-04-13

基金项目： 国家自然科学基金资助项目 (81001322，30972766)，广东省自然科学基金资助项目 (9451503102003499)，高校博士点专项科研基金资助项目 (20094402110004)。

作者简介： 张   驰 (1985-  )，女，河南省新乡市人，硕士研究生。#：对本文的贡献与第一作者等同。

*Correspondence to：LI Kang-sheng，E-mail：ksli@ stu.edu.cn

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