维生素A和E抗辐射氧化损伤作用的研究

 

王   欣/王   璐/陈宏莉/柏  桦/王   钊/刘江正/海春旭*

( 第四军医大学军事毒理学教研室，陕西  西安  710032 )

 

The effect of vitamin A and vitamin E against Co60 radiation-induced oxidative injury

 

WANG Xin，WANG Lu，CHEN Hong-li，BAI Hua，WANG Zhao，LIU Jiang-zheng，HAI Chun-xu*

(Department of Toxicology, School of Preventive Medicine, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi, China)

 

【摘要】 目的： 探讨维生素A ( vitamin A，VA)和维生素E (vitamin E，VE)抗辐射氧化损伤的相互作用。方法：实验分为VA、VE抗辐射氧化损伤实验和VA、VE联合应用抗辐射氧化损伤实验。前者设阴性对照组、阳性对照组、VA (30 mg/kg)组、VE (30 mg/kg)组及VA+VE半量 (均为15 mg/kg)联合用药组。各组大鼠每天用受试物灌胃1次，连续灌胃6 d，第7天除阴性对照组外其它各组大鼠均以6 Gy 的60Co照射，再继续灌胃3 d后处死大鼠，取血、脑和肝组织，测定MDA、SOD、CAT等指标。VA、VE联合应用抗辐射氧化损伤实验设阴性对照组、阳性对照组、VE组 (30 mg/kg)、VE (30 mg/kg)与4个不同VA剂量(分别为2.5、5、10、20 mg/kg)的联合应用组，共7组。各组大鼠的处理同前述。结果：与阳性对照相比，单独补充VA、VE均可以对辐射损伤产生一定的保护作用，血清、脑、肝脏的MDA含量均显著降低 (P 均< 0.05)，各种抗氧化酶活性均显著升高 (P 均< 0.05)。与阴性对照组比较，固定VE剂量 (30 mg/kg)与不同VA剂量联合应用时，大鼠血清、脑、肝脏的MDA含量均显著增加，CAT和SOD活性降低，脑、肝脏组织中VE含量显著减少 (P均＜0.05)，并具有一定的剂量-效应关系。VA、VE联合应用时产生的抗氧化作用明显弱于VA、VE单独使用的效果。结论：维生素A和维生素E均具有抗辐射氧化损伤的作用，但在一定的剂量下，VA、VE联合应用可以产生拮抗作用。

【关键词】 维生素A；维生素E；辐射损伤；丙二醛；超氧化物歧化酶；过氧化氢酶

 中图分类号： R818.74      文献标识码： A     文章编号： 1004-616X(2011)03-0181-05      doi: 10.3969/j.issn.1004-616x.2011.03.005

【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To study the antagonistic effects of vitamin A and vitamin E against Co60 radiation-induced oxidative injury. METHOD：Experiment 1：Rats were divided into five groups，including control， radiation，radiation + vitamin A，radiation + vitamin E and radiation + half dose of vitamin A and vitamin E. Before exposure to radiation， rats were treated with intragastrically with 30 mg/kg vitamin A，30 mg/kg vitamin E，or 15 mg/kg vitamin A + 15 mg/kg vitamin E. Experiment 2：Rats were divided into seven groups，including control， radiation，radiation + 30 mg/kg vitamin E，radiation + 30 mg/kg vitamin E + different concentrations of vitamin A，ranging from 2.5 mg/kg to 20 mg/kg. Before the exposure to radiation，rats received intragastrically 30 mg/kg vitamin E，or 30 mg/kg vitamin E + different concentration of vitamin A. At day 7，rats were exposed to 6 Gy Co60 radiation. At day 10，the rats were sacrificed，and serum and tissues were collected for analysis. RESULTS：Vitamin A and vitamin E alone could protect the rats against the injury induced by radiation. When the concentration of vitamin E was fixed at 30 mg/kg，different concentrations of vitamin A resulted in the increase of MDA，the decrease of SOD and CAT activities and the content of vitamin E，in a dose-dependent manner.  CONCLUSION：Under certain concentration，vitamin A and vitamin E could produce antagonistic effect.

【KEY  WORDS】 vitamin A；vitamin E；radiation；MDA；SOD；CAT

 

近些年，对辐射引起自由基损伤机制的研究越来越广泛和深入[1]，同时，辐射损伤的防护一直是研究者所面临的一个重要课题，采用抗氧化剂抑制氧化应激损伤受到越来越多的重视[2-3]。大量研究表明：维生素E (vitamin E，VE)作为结构脂蛋白或酶的类脂成份的保护剂，对细胞疏水侧膜结构抗氧化损伤的作用没有引起足够的重视，近几年大量文献报道，维生素A (vitamin A，VA)是机体内一种有效的捕捉活性氧的抗氧化剂，它不仅能淬灭1O2，还能清除O2-.和HO·，防止脂质过氧化。我们前期的研究发现VA、VE对各种微粒体脂质过氧化均有很好的抑制作用[4]。以往一般认为，抗氧化剂之间存在协同增强效应。但是，由于自由基存在的形态具有多样性，自由基反应又是链式反应，因此应用单一的抗氧化剂往往存在不足。各种抗氧化剂之间是否均表现为抗氧化协同作用，是否在某些条件下也存在拮抗作用？为此，我们观察了VA、VE联合用药抗辐射氧化损伤的作用及其相互关系。

 

1  材料与方法

1.1  动物

雄性健康SD大鼠120只，由第四军医大学动物中心提供，体质量180～220 g。

1.2  试剂与仪器

VA、VE、丙二醛 (malondialdehyde，MDA)标准品系Merck公司产品；硫代巴比妥酸 (thiobarbital acid， TBA)、硝基四唑蓝 (nitro blue tetrazolium ，NBT)生化试剂，上海试剂厂 (分析纯)；牛血清白蛋白 (bovine serum albumin ，BSA)，上海生物化学试剂公司进口分装。日本MPF-4荧光分光光度计、上海752型可见分光光度计、LD4-2型离心机、上海多功能电子恒温浴箱。

1.3  实验分组

1.3.1  VA、VE抗辐照氧化损伤作用   将50只SD大鼠随机分为阴性对照组、辐照阳性对照组、VA组、VE组、VA+VE半量联合用药组等，共5组，分笼喂养。阳性组和阴性对照组大鼠用去除VA和VE的食用菜子油每天按5 ml/kg灌胃1次，VA组按VA 30 mg/kg，VE组按VE 30 mg/kg，半量联合用药组按VA 15 mg/kg和VE 15 mg/kg每天灌胃1次，连续灌胃6 d，第7天除阴性对照组外其它各组大鼠均以6 Gy 60Co 剂量照射，继续灌胃 3 d后，动物处死取血、脑和肝组织，测定丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)等的含量。

1.3.2  VA、VE联合应用抗辐照氧化损伤作用   将70只SD大鼠随机分为阴性对照组、辐照阳性对照组、VE (30 mg/kg)组、VE (30 mg/kg)+ VA (2.5 mg/kg)组、VE (30 mg/kg) + VA(5 mg/kg)组、VE (30 mg/kg)+ VA (10 mg/kg)组、VE (30 mg/kg)+ VA(20 mg/kg)组，共7组。各组大鼠的其它处理同1.3.1。

1.4  检测方法

MDA活性采用八木国夫荧光法[5] ；SOD含量的测定采用改良的盐酸羟胺法[6]；用南京建成试剂盒测定CAT活性；蛋白含量的测定采用Lorry’s法[7]；VE含量采用微量荧光测定法[8]。

1.5  统计学方法

实验结果表示为-x ±s，使用统计软件SPSS 11.0 分析数据，采用one-way ANOVA进行多组均数之间差别的统计学检验，数据的两两比较采用LSD法,以α = 0.05为检验水准。

 

2  结  果

2.1  VA、VE对辐射后大鼠血清、脑、肝脏MDA含量的影响

如表1所示，无论在血清还是在肝组织、脑组织中，MDA含量的变化趋势十分相似。照射后，阳性组MDA的含量明显升高，与其它组间的差异均具有统计学意义(P＜0.05)，说明辐射可诱发机体脂质过氧化反应。与阳性组相比，VA和VE组MDA含量均显著降低(P＜0.05)。单纯补充VE组MDA含量与单纯补充VA组比较差异无统计学意义。除肝组织MDA含量外，在半量联合应用VA、VE组中，MDA含量与单独给予VA、VE组相比有降低的趋势 (表1)。然而，在联合应用实验中，VA剂量低于20 mg/kg时的各剂量组，其血清和脑组织MDA含量随着VA剂量的逐渐减低而增加 (图1和图2)，而肝组织MDA含量随着VA剂量的逐渐增加而增加 (图3)，且均存在着一定的剂量-效应关系。可见，VA、VE联合应用，其抗氧化作用不是简单的叠加作用或协同作用，在一定剂量条件下，二者之间也存在着拮抗作用。

2.2  VA、VE对辐射后大鼠血清、肝脏SOD活性的影响

各组大鼠SOD活性的变化见表2。结果显示，在血清和肝组织中，阳性对照组总超氧化物歧化酶 (total-SOD，T-SOD)和含锰超氧化物歧化酶 (Mn-SOD)活性均应激性的上调。与阳性组相比，VA、VE组T-SOD和Mn-SOD活性均显著降低。并且，与阴性组相比，VA、VE组T-SOD和Mn-SOD活性在一定程度上也显著降低。这提示，VA、VE在改善氧化损伤的同时，具有一定的消耗SOD的能力。VA 和VE半量组对SOD的消耗明显减轻，说明二者可能存在一定的拮抗作用。在联合应用实验中，VE与不同剂量的VA各联合应用组在VA 20 mg/kg时，血清和肝组织SOD活性显著低于阳性组 (图4和图5)，其变化存在着一定的剂量-效应关系，提示VA、VE二者均有一定的消耗SOD的作用。30 mg/kg VE 与5 mg/kg VA联合应用时，血清和肝组织SOD活性均达到最高点。这说明30 mg/kg VE与5 mg/kg VA间产生了最强的拮抗作用，而抑制了各自的消耗SOD的作用。

2.3  VA、VE对辐射后大鼠血清、脑、肝脏CAT活性的影响

如表3所示，辐射后，阳性对照组大鼠血清、脑、肝脏CAT活性较阴性组明显下降，VA组、VE组及VA和VE半量联合组对CAT活性均有保护作用。在各个不同的剂量组中，VE组保护CAT效果最好，VA和VE联合半量组CAT活性与VE组相比反而下降，说明联合用药VA对VE产生拮抗作用。图6、7和图8所示，固定VE剂量，VA剂量低于20 mg/kg时，血清、脑、肝脏CAT活性显著低于VE组，其变化存在着一定的剂量效应关系，这进一步验证了VA对VE拮抗作用。

2.4  VA、VE对辐射后大鼠脑、肝脏VE含量的影响

在脑、肝脏中，阳性组VA、VE含量与阴性组相比显著降低，说明辐射造成脂质过氧化而导致VE被消耗。单纯补充VE可以使VE水平显著升高，对辐射造成的损伤起到明显的保护作用 (图9、10)。然而，在VA、VE联合应用时，两种组织中VE水平明显降低，并具有一定的剂量-效应关系。尤其是在肝组织中，随着VA剂量的增加，VE的含量逐渐减少 (图10)。这些结果提示在VA、VE的相互作用中，VA具有消耗VE的作用。

3  讨  论

自由基反应是链式连锁放大反应，在自由基的链式连锁放大反应中常有多种自由基生成或相互转换。由于机体存在许多种自由基反应形态，因而单一或少数自由基清除剂如VC、VE等不可能有效阻断这些多态链式反应，有些外源性抗氧化剂如SOD、GSH等不能进入细胞内，很难发挥有效的清除作用。另外，SOD催化O2-.生成产物是H2O2，此产物对机体仍有损害作用。之所以单独或少数抗氧化剂在实验室研究中效果显著，但用于机体时效果不显著，原因之一是由于存在自由基链式反应，忽视了自由基的链式连锁放大反应，在选择抗氧化剂的功能时就会发生选取的单一性，而缺乏针对反应的多功能性，所以作用效果欠佳。由于有些抗氧化剂之间可能存在拮抗作用，所以应用多种抗氧化剂时不能盲目的组合，否则会导致其联合时的作用效果更差。

在本实验中，我们发现VA、VE同时使用具有拮抗作用，从而导致其抗氧化损伤作用降低。VA、VE 的抗辐射作用存在一定的剂量-效应关系。本实验研究中，采用固定VE剂量 [30 mg/(kg·d)]，变化VA剂量，由倍量 [20 mg/(kg·d)]到全量 [10 mg/(kg·d)]到半量 [5 mg/(kg·d)]到1/4量 [2.5 mg/(kg·d)]，结果表明，随着VA剂量的变化，血清、脑、肝脏的MDA含量、CAT活性，血清、肝脏的SOD活性，以及脑和肝脏的VE含量等的变化都存在着一定的剂量-效应关系。

上世纪90年代初，海春旭教授首次提出了 “抗氧化剂复合链”理论，对于指导抗自由基和活性氧损伤研究，以及发挥更好的抗辐射损伤作用，具有重要意义[9]。联合使用抗氧化剂可以提高清除自由基损伤的效果，但抗氧化剂之间的相互作用研究报告并不多见。人们对抗氧化剂之间是否具有协同或拮抗作用的认识仍很模糊，而且在不多的报道中观点也各不相同。因此，进一步利用病理、生化和自由基、活性氧检测相关技术，探讨自由基及其清除剂在辐射损伤中的作用，以及抗氧化剂之间的相互作用，对于抗氧化剂的联合应用具有重要的理论意义和实际意义。

 

参考文献

[1]  Badr El-Din NK. Protective role of sanumgerman against [gamma]-irradiation-induced oxidative stress in Ehrlich carcinoma-bearing mice [J].  Nutrit Res，2004，24 (4)： 271-291.

[2]  Mansour HH，Hafez HF，Fahmy NM，et al.  Protective effect of N-acetylcysteine against radiation induced DNA damage and hepatic toxicity in rats [J]. Biochemi Pharmacol，2008， 75 (3)：773-780.

[3]  Konopacka M，Rzeszowska-Wolny J.  Antioxidant vitamins C，E and [beta]-carotene reduce DNA damage before as well as after [gamma]-ray irradiation of human lymphocytes in vitro [J]. Mut Res， 2001，491 (1/2)：1-7.

[4]  赵海龙，刘   瑞，梁   欣，等.  维生素A、E、C对大鼠肝微粒体LPO模型的影响[J]. 第四军医大学学报，2008，29 (10)： 896-899.

[5]  冯安吉，海春旭，杨兴斌，等.  VA与VE对梭曼 (GD)染毒大鼠MDA和MAO的影响[J]. 第四军医大学学报，2001，22 (10)：888-890.

[6]  Wang X，Hai C，Liang X，et al.  The protective effects of Acanthopanax senticosus Harms aqueous extracts against oxidative stress：role of Nrf2 and antioxidant enzymes [J]. J Ethnopharmacol，2010，127 (2)：424-432.

[7]  Lowry O，Rosebrough N，Farr A，et al. Protein measurement with the folin phenol reagent [J]. J Biol Chem，1951，193 (1)：265.

[8]  梁   欣，李文丽，杨兴斌，等. 补充VA、VE对梭曼中毒大鼠体内抗氧化能力影响的初探[J]. 细胞与分子免疫学杂志， 2001，17 (5)：495-496.

[9]  海春旭. 自由基医学[M].  西安：第四军医大学出版社，2006：107-114.

 

收稿日期： 2011-03-03；修订日期：2011-04-01

作者简介： 王  欣 (1983-  )，男，博士研究生，研究方向：自由基生物学与医学。

*Correspondence to：HAI Chun-xu，E-mail：cx-hai@fmmu.edu.cn

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