脂多糖预刺激对大脑皮质星形胶质细胞和小胶质细胞NO分泌水平的影响

 

苏   芸1/谢泽锋2 /辛   岗1/许燕璇1/李康生1，*

( 1. 汕头大学医学院微生物学与免疫学教研室，广东 汕头   515041 ； 2. 汕头大学医院第一附属医院，广东   汕头   515041 )

 

Lipopolysaccharide-preconditioning influences the NO secretion from cultured cerebral astrocytes and microglia in vitro

 

SU Yun1， XIE Ze-feng2， XIN gang1，XU Yan-xuan1， LI Kang-sheng1，*

(1. Department of Microbiology and Immunology, Shantou University Medical College, Shantou 515041; 2. The First Affiliated Hospital, Shantou University Medical College, Shantou 515041, Guangdong, China)

 

【摘要】 目的： 探讨脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)预刺激对大脑皮质星形胶质细胞和小胶质细胞NO分泌水平的影响。 方法： 体外分离、纯化、培养星形胶质细胞和小胶质细胞。培养细胞分设LPS预刺激组(先用10 ng/ml LPS预刺激18 h后，改用1 μg/ml的 LPS再刺激)，LPS 10 ng/ml单次刺激组，LPS 1 μg/ml单刺激组与对照组(不用LPS刺激)。分别于LPS刺激后6、24、48 h收集细胞培养上清，用硝酸还原酶法检测NO水平。 结果： 星形胶质细胞和小胶质细胞，LPS预刺激组在24 h后， NO水平增加，明显高于相应时间点LPS 1 μg/ml单次刺激组 (P均<0.05)；其中，星形胶质细胞分泌NO的时间较长，可持续到48 h，与相应单次刺激组比较差异具有统计学意义 (P<0.05)。 结论： LPS体外预刺激神经胶质细胞，可促使细胞分泌NO的水平升高。

【关键词】 星形胶质细胞；小胶质细胞；脂多糖；预刺激；一氧化氮

 中图分类号： R365      文献标识码： A      文章编号： 1004-616X(2011)03-0176-05       doi: 10.3969/j.issn.1004-616x.2011.03.004

【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To study the influences of lipopolysaccharide(LPS) preconditioning on NO secretion in cultured cerebral astrocytes and microglia. METHODS： Mice cerebral astrocytes and microglia were isolated and purified in vitro. Thereafter， these glial cells were divided into 4 groups： LPS-primed group， 10 ng/ml LPS treated group， 1 μg/ml LPS treated group and non-treated group. The LPS-primed group was preconditioned with 10 ng/ml of LPS for 18 hours. After the preconditioning， the cells received the second treatment with 1 μg/ml of LPS for 6 hours， 24 hours and 48 hours. Then cultured supernatants of  all 4 groups were collected. NO level in the supernatants was determined by Griess method. RESULTS： Both in cultured astrocytes and microglia，NO level of the LPS-primed group was increased at 24 hours with LPS re-treatment  compared with the 1 μg/ml LPS-stimulated group (P<0.05). Moreover， at 48 hours with LPS re-treatment， a long-lasting and significant enhancing effect was found in astrocytes (P<0.05). CONCLUSION： LPS preconditioning could enhance NO secretion ability  in cultured cerebral astrocytes and microglia.

【KEY  WORDS】 astrocyte；microglia；lipopolysaccharide；preconditioning；nitric oxide

 

在中枢神经系统，星形胶质细胞与小胶质细胞是众多活性分子产生的主要来源。感染、损伤或退行性改变，都可能导致神经胶质细胞分泌促炎症因子发生改变，而中枢神经系统中这些活性分子的变化可能会引发神经元细胞及胶质细胞的凋亡以及免疫病理损伤[1-2]。NO是一种多功能分子，一定浓度的NO有利于多种生理活动的调节。感染、应激、细胞因子可诱导胶质细胞中诱导型一氧化氮合酶 (inducible nitric oxide synthase，iNOS)表达，进而使胶质细胞产生高水平NO[3-4]，持续高水平NO可致星形胶质细胞和神经元释放具有毒性作用的介质[5-8]，进而损伤细胞本身[9-11]。

研究表明，体内或体外小剂量脂多糖 (lipopoly-saccharide， LPS)预处理后的单核细胞、巨噬细胞或宿主对LPS再刺激的反应性明显下降，其表现为炎性因子的分泌受抑制[12]。同样的， LPS预处理，可对脑卒中、脑创伤或是某些感染起保护作用[13-14]，并具有剂量和时间依赖关系[15]，这可能与某些信号分子以及免疫细胞功能发生了重新调配有关 [12，16-17]。星形胶质细胞与小胶质细胞是脑内的活性细胞，而采用脂多糖小剂量预处理(模拟革兰阴性菌轻型感染)，这些细胞分泌功能的变化尚不清楚。为此，我们采用LPS预刺激星形胶质细胞和小胶质细胞，检测细胞NO分泌水平的变化，为探讨LPS预刺激对脑部神经细胞免疫反应的重新调节机制提供实验依据。

 

1  材料与方法

1.1  材料与试剂

C57BL/6J小鼠由汕头大学医学院实验动物中心提供；LPS (Escherichia coli，O111：B4)购自美国Sigma公司；DMEM/F12培养基、胰酶 (0.25% trypsin/0.02% EDTA) 购自美国Gibco公司，胎牛血清(FBS)购自杭州四季青公司；NO试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所。

1.2  方法

1.2.1  新生小鼠大脑皮层神经胶质细胞的培养  分离1~2 d新生C57BL/6J小鼠大脑皮质，将其置于DMEM/F12 (1∶1，V/V)培养基中吹打分散后，用50 μm滤器过滤得到细胞悬液。37 ℃贴壁30 min去除成纤维细胞。未贴壁细胞于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。接种后第2天和第4天，弃去未贴壁的细胞，更换培养基。以后每5～7 d更换一次培养基，至胶质细胞长成单层。

1.2.2  小鼠大脑皮层星形胶质细胞与小胶质细胞的分离   用0.05%胰酶于37 ℃作用长成单层的胶质细胞约10 min，将含有星形胶质细胞的胰酶液经含10%FBS的 DMEM/F12培养基终止消化，离心后培养1 d。将细胞培养瓶固定于定轨摇床(上海智诚)中，37 ℃、200 r/min、振幅30 mm，水平震荡60 min，弃悬浮细胞，加入含10%FBS的DMEM/F12培养基继续培养1 d后，按上述方法再次进行震荡分离，得到纯化后的星形胶质细胞。

另将长成单层的混合胶质细胞用0.1%胰酶于37 ℃作用约15 min，镜下观察星形胶质细胞脱落后，弃去消化液，DMEM/F12培养基清洗2遍，加入胰酶消化液(含0.25% trysin/0.02% EDTA ) 于37 ℃作用5～10 min， 得到小胶质细胞组分[18]，用含10% FBS的 DMEM/F12培养基终止消化、离心后用含10% FBS的DMEM/F12培养基培养。

分离后的星形胶质细胞与小胶质细胞，分别使用胶质细胞纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein， GFAP) 和CD11b抗体进行免疫荧光法检测纯度。星形胶质细胞与小胶质细胞按每孔1×106个细胞的密度接种于6孔细胞培养板，用于后续实验。

1.2.3  实验分组  已纯化星形胶质细胞和小胶质细胞接种到6孔板24 h后，分设LPS预刺激组、LPS 10 ng/ml单次刺激组、LPS 1 μg/ml单刺激组与未刺激对照组。预刺激组先用10 ng/ml LPS预刺激18 h后，改用1 μg/ml的 LPS再刺激，之后6、24、48 h分别收集细胞培养上清，－20 ℃保存待用；各单刺激组则不进行预刺激，分别用10 ng/ml、1 μg/ml LPS单次刺激后6、24、48 h细胞培养上清；对照组不用LPS刺激细胞。

1.2.4  NO水平的测定  采用硝酸还原酶法检测NO水平。用硝酸还原酶将上清中硝酸根离子 (NO3- )还原为亚硝酸根离子 (NO2- )，进而在酸性条件下用Griess试剂与之反应测定标准曲线，测定亚硝酸盐量，以代表总NO水平。方法简述如下：所有试剂冰上解冻后，用细胞培养基把标准品KNO2进行稀释；标准品及培养上清上样量为30 μl，随后加入2 mmol/L NADPH 2 μl 以及2 U/ml 硝酸盐还原酶10 μl，在30 ℃孵育 30 min；分别加入50 μl Griess Reagent I 和 50 μl Griess Reagent II，室温混匀后在540 nm检测吸光度值，根据不同浓度亚硝酸盐标准曲线确定NO浓度。

1.2.5  统计学方法  数据均用-x ±s表示。采用SPSS 13.0统计软件对数据进行单因素方差分析，以α = 0.05为检验水准。

 

2  结  果

2.1  大脑皮层星形胶质细胞和小胶质细胞培养及纯度鉴定结果

采用抗GAFP抗体进行免疫荧光染色后，星形胶质细胞均出现特异性荧光染色。计数500个细胞，荧光染色阳性的星形胶质细胞占97%以上(图1A、B)。

小胶质细胞培养后，形态为圆形、卵圆形或扁长，细胞较小，突起短，并可见到大量的棘突。采用抗CD11b抗体进行免疫荧光染色，计数10个视野500个细胞，荧光阳性的小胶质细胞占95%以上(图1C、D)。

 2.2  LPS预刺激星形胶质细胞和小胶质细胞不同时间点NO的变化趋势

如图2A 显示。采用10 ng/ml， 1 μg/ml LPS进行单次刺激组，以及预刺激组的星形胶质细胞产生NO水平在6 h时，各组水平间无明显变化；24 h开始升高，并持续到48 h。在24 h，1 μg/ml LPS单次刺激组和预刺激组NO水平显著高于对照组 (P 均<0.05)；在48 h， 预刺激组仍显著高于对照组(P <0.05，图2A)。

对于小胶质细胞， 1 μg/ml LPS单次刺激组、预刺激组NO水平在24 h升高明显，与相应未刺激对照组相比差异具有统计学意义 (P <0.05， P <0.01)。在48 h，10 ng/ml、1 μg/ml LPS单次刺激组，及预刺激组产生NO水平降低，后两组与其24 h时相比差异具有统计学意义 (P <0.05， P<0.01) (图2B)。

2.3  LPS预刺激对星形胶质细胞和小胶质细胞产生NO的影响

在星形胶质细胞培养上清中，预刺激组在LPS再刺激24 h、48 h时NO水平较未刺激对照组、10 ng/ml和1 μg/ml LPS单次刺激组升高，与对照组间的差异具有统计学意义 (P<0.05)(图3A)；而小胶质细胞培养上清中，预刺激组在LPS再刺激24 h产生的NO水平较未刺激对照组、10 ng/ml、1 μg/ml LPS单次刺激组明显升高，其差异均有统计学差异 (P均 <0.05)( 图3B)。

 

3  讨  论

宿主或培养的单核/巨噬细胞等炎性细胞在首次接受LPS刺激后，对再次LPS刺激的反应下降，表现为LPS所导致发热、体质量下降、死亡等病理生理现象减轻甚至消失，并且伴有某些细胞因子表达下调或无表达[19]。这种现象被认为是LPS耐受，是一种宿主适应反应，可以减轻由LPS刺激引起的单核/巨噬细胞过度激活所致的炎症损伤。星形胶质细胞与小胶质细胞是脑部众多活性介质的主要生产者，尤其是小胶质细胞，是大脑中主要的免疫细胞，参与神经系统的免疫调节、组织修复或是炎症损伤等病理生理过程。在脑损伤和免疫刺激的情况下，神经胶质细胞活化，出现多种分子如MHC分子、细胞间粘附分子、iNOS的上调及多种炎性因子的释放，如NO、TNF、IL-1的水平升高[20-21]。其中，NO是一种活性分子，可在iNOS催化下诱导产生。一定剂量的NO可调节神经突触的可塑性、血流和发育等多种生理过程，而高水平NO[3-4]导致星形胶质细胞和神经元释放具有毒性作用的谷氨酸盐[5-8]，谷氨酸盐的毒性作用或活化小胶质细胞产生的过氧化物与NO形成过氧硝酸盐[122-124]可使线粒体受到损伤，最终导致神经元的死亡[8-10]。本研究在体外培养星形胶质细胞和小胶质细胞，尝试利用较小剂量LPS预刺激，模拟革兰阴性菌轻型感染，再接受较大剂量LPS刺激，检测其分泌NO水平的变化， 结果表明无论是星形胶质细胞还是小胶质细胞，在再次接受LPS刺激后24 h， LPS预刺激组较单次刺激组NO分泌均明显增加，其中星形胶质细胞分泌NO的时间较长，可持续到48 h。Uwe-Karsten等[22]报道的体内实验，LPS预处理脑内可伴随一些炎性介质的表达抑制，如TNF、NO等。而本结果显示在体外预刺激神经胶质细胞其分泌NO的水平却未表现出抑制现象，而是免疫活化作用。一方面这可能与细胞来源的异质性有关，通常对LPS预刺激表现出分泌细胞因子低反应性的为单核巨噬细胞，而本研究检测的是大脑皮质胶质细胞。另一方面，NO的产生受到多种分子的调控，LPS预刺激后可能启动了不同的信号途径，一些信号分子的重新调配可能会对某种分子产生不同的影响；同时，体内环境和体外环境不同，调节网络复杂，因此就可能出现体内与体外结果不一致，在体外预刺激时可不表现为NO的分泌耐受。但需要指出的是，由于NO持续高水平，具有神经毒性作用。即使LPS预刺激会引起其他细胞因子的低表达，但若NO与其他细胞因子的调节失衡，LPS预刺激引起的免疫低反应性也有可能因为某些介质过强的效应对机体产生损伤作用。本实验将LPS预刺激延续到体外培养的星形胶质细胞与小胶质细胞中，观察了NO产生的变化，这为进一步探讨LPS耐受现象在神经系统中的作用提供实验基础。

 

参考文献

[1]  Nunoi H，Mercado MR，Mizukami T，et al. Apoptosis under hypercytokinemia is a possible pathogenesis in influenza-associatedencephalopathy[J]. Pediatr Int，2005，47 (2)： 175-179.

[2]  Hu S，Peterson PK，Chao CC. Cytokine-mediated neuronal apoptosis [J]. Neurochem Int，1997，30 (4/5)： 427-431.

[3]  Chao CC. Cytokine-stimulated astrocytes damage human neurons via a NO mechanism[J]. Glia，1996，16 (3)： 276-284.

[4]  Murphy S. Production of nitric oxide by glial cells： regulation and potential roles in the CNS[J].  Glia，2000，29 (1)： 1-14.

[5]  McNaught KSP，Brown GC. Nitric oxide causes glutamate release from brain synaptosomes following inhibition of mitochondrial function[J].  J Neurochem，1998，70 (4)： 1541- 1546.

[6]  Bal-Price A，Brown GC.  Inflammatory neurodegeneration mediated by nitric oxide from activated glia-inhibiting neuronal respiration， causing glutamate release and excitotoxicity[J]. J Neurosci， 2001，21 (17)： 6480-6491.

[7]  Trabace L，Kendrick KM. Nitricoxide can differentially modulate striatal neurotransmitter concentrations viasoluble guanylate cyclase and peroxynitrite formation[J]. J Neurochem， 2000，75 (4)： 1664-1674.

[8]  Bal-Price A，Moneer Z，Brown GC.  Nitric oxide induces rapid，calcium-dependent release of vesicular glutamate and ATP from cultured rat astrocytes[J].  Glia，2002，40 (3)：312-323.

[9]  Radi  R，Cassina H，Hodara  R. Nitric oxide and peroxynitrite interactions with mitochondria[J].  Biol Chem，2002，383 (3/4)： 401-409.

[10] Gunasekar PG，Kanthasamy AG，Borowitz JL，et al.  NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species： implication for cell death[J]. J Neurochem，1995，65 (5)：2016-2021.

[11] Stewart VC，Heslegrave AJ，Brown GC，et al. Nitric oxide-dependent damage to neuronal mitochondria involves the NMDA receptor[J]. Eur J Neurosci，2002，15 (15)： 458-464.

[12] Cross AS. Endotoxin tolerance current concepts in historic persperctive [J]. J Endotoxin Res，2002，8 (2)： 83-98.

[13] Stevens SL，Stenzel-Poore MP. Toll-like receptors and tolerance to ischaemic injury in the brain [J]. Biochem Soc Trans， 2006，34 (6)： 1352-1355.

[14] Leung PY，Packard AE，Stenzel-Poore MP. It's all in the family： multiple Toll-like receptors offer promise as novel therapeutic targets for stroke neuroprotection[J]. Future Neurol，2009，4 (2)： 201-208.

[15]  Rosenzweig HL，Minami M，Lessov NS，et al.  Endotoxin precon- ditioning protects against the cytotoxic effects of TNF-a after stroke： a novel role for TNFa in LPS-ischemic tolerance[J]. J Cereb Blood Flow Metab，2007，27 (10)： 1663-1674.

[16] Medvedev AE，Lentschat A，Wahl LM，et al.  Dysregulation of LPS  induced  Toll-like recepror-4 MyD88 complex formation and IL-1 receptor associated kinase 1 activation in endotoxin tolerant cells[J]. J Immunol，2002，169 (9)：5209-5216.

[17] Jacinto R，Hartunq T，McCall C，et al. Lipopolysaccharide and lipopoteichoic acid induced tolerance and cross tolerance： distinct alterations in IL-1 receptor associated kinase[J]. J Immunol，2002，168 (12)： 6136-6141.

[18] Floden AM，Combs CK.Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype[J]. J Neurosci Methods，2007，164 (2)： 218-224.

[19] Cavaillon JM，Adrie C，Fitting C，et al.  Endotoxin tolerance： is there a clinical relevance?[J].  J Endotoxin Res，2003，9 (2)： 101-107.

[20] Lee SC，Liu W，Dickson DW，et al. Cytokine production by human fetal microglia and astrocytes. Differential induction by lipopolysaccharide and IL-1 beta[J]. J Immunol，1993，150 (7)： 2659-2667.

[21]  Sawada M，Kondo N，Suzumura A，et al. Production of tumor necrosis factor-alpha by microglia and astrocytes in culture[J]. Brain Res，1989，491 (2)： 394-397.

[22] Uwe-Karsten H，Thomas VJ，Jonathan K. Toll-like receptors： rolesin neuroprotection?[J].  Trends in Neurosciences，2008，31 (4)： 176 - 182.

 

收稿日期： 2011-03-21；修订日期：2011-04-01

基金项目： 国家自然科学基金项目 (81001340，30771988)，广东省医学科研基金项目 (B2010211)，汕头市科技计划资助项目 (2009-70)

作者简介：苏   芸 (1978-   )，女，讲师，博士研究生，研究方向：抗感染免疫与神经免疫调节。E-mail：yunsu112001@yahoo.com

*Correspondence to：LI Kang-sheng，E-mail：ksli@stu.edu.cn

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