真菌提取物AMH的肿瘤化学预防活性组分追踪

 

贺小琼/李凝诗/李   凤/赵   燕/武金聪/朱启应/原   茵

( 昆明医学院公共卫生学院，云南  昆明  650500 )

 

Identification of the cancer chemoprevention component in fungus plant extract AMH

 

HE Xiao-qiong， LI Ning-shi， LI Feng， ZHAO Yan， WU Jing-cong， ZHU Qi-ying， YUAN Yin

(School of Public Health, Kunming Medical College, Kunming 650500, Yunnan, China)

 

【摘要】 目的： 对真菌提取物AMH进行活性组分追踪，为分离其活性化学成分、开发抗癌药物提供基础。 方法：采用苯并(a)芘诱发小鼠肿瘤实验，评价AMH的5个组分对苯并(a)芘诱发肿瘤的预防作用。 结果： 苯并(a)芘能诱导昆明种小鼠多个脏器发生肿瘤。AMH 5个组分对苯并(a)芘诱发小鼠肿瘤的作用存在明显差异，与阴性对照组相比，组分A、B、C、E具有促进肺腺瘤发生的作用(P<0.05)； 组分B和E能抑制苯并(a)芘诱导的脏器肿瘤 (P<0.05)；组分D具有抑制苯并(a)芘诱发小鼠脏器肿瘤和肺腺瘤的作用 (P<0.01)，是AMH中具有肿瘤化学预防作用的活性组分。 结论： AMH组分D具有肿瘤化学预防作用，是下一步活性追踪的功效组分。

【关键词】 真菌提取物AMH；肿瘤；苯并(a)芘；肺腺瘤

 中图分类号： R34       文献标识码： A       文章编号： 1004-616X(2011)03-0166-05       doi: 10.3969/j.issn.1004-616x.2011.03.002

【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To identify the cancer chemoprevention component in fungus plant extract AMH， which has been proved having antimutagenic and cancer chemopreventive effect. Present study may provide scientific data for the further separation of bioactive agents and for anticancer drug development. METHODS：The benzo(a)pyrene-induced oncogenesis assay was used to evaluate the cancer chemopreventive effect of the 5 components separated from fungus extract AMH. RESULTS：Benzo(a)pyrene could induce organ cancers and lung adenoma in Kunming mice. Compared with the control group，components A， B，C and E could promote the occurrence of lung adenoma (P<0.05). Components B and E could inhibit the occurrence of cancers induced by benzo(a)pyrene (P<0.05) whilst  component D could inhibit both cancers and lung adenoma induced by benzo(a)pyrene (P<0.01). Component D was the bioactive component which had cancer chemopreventive effect. CONCLUSION： Component D had cancer chemopreventive effect. It was the functional component worthy of further identification of the bioactive agents.

【KEY  WORDS】 fungus extract AMH； tumor； benzo(a)pyrene； lung adenoma

 

在前期的生物资源筛选中我们发现，云南一种特殊真菌的提取物AMH (antimutagen-he)具有较好的抗突变作用，能完全抑制一些致癌物和致突变物的致突变作用[2]，能显著抑制苯并(a)芘[benzo(a)pyrene，B(a)P]的致突变作用和苯并(a)芘诱导的小鼠肺腺瘤及其它脏器肿瘤 [3-4]。我们进一步采用植物化学分离手段，对该提取物进行了逐级分离，将其提取物AMH分离成AMH-A、B、C、D和E等5个组分，并经Ames试验检测，AMH-D和AMH-E组分具有强抗突变作用，其余3个组分无抗突变作用或作用很弱。我们于2007年在澳大利亚检测了AMH-C、D和E 3个组分对偶氮甲烷 (azoxymethane， AOM)诱导C57BL/6J小鼠结肠癌的化学预防作用[5]，结果显示，AMH-D能显著性抑制AOM 诱导的小鼠结肠癌。本研究采用强致癌物B(a)P诱导小鼠肺腺瘤和其它脏器肿瘤，观察AMH及其分离的5个组分对B(a)P诱导小鼠肿瘤的化学预防作用，对其进行活性组分追踪，为下一步活性化学成分分离提供研究基础。

 

1  材料与方法

1.1  实验动物与分组

160只昆明种小白鼠，由昆明医学院实验动物中心提供，雌雄各半，体质量18~23 g。将小鼠按体质量随机分成8组，分别为阴性对照组(蒸馏水)、B(a)P对照组、AMH组、AMH-A组、AMH-B组、AMH-C组、AMH-D组和AMH-E组，每组20只小鼠，雌雄各半。动物适应性饲养观察2 d后开始实验。

1.2  样品的配制

对真菌提取物AMH进行萃取分离[4]，分别得到AMH-A、B、C、D和E 5个组分。这5个组分占总样品AMH的比重依次为20%、45%、11%、20%、4%。总样品AMH和组分AMH-A、AMH-B能在水中溶解成混悬状态，由于给药剂量较大，因此以蒸馏水溶解成混悬状，采用灌胃给药，每只小鼠按0.02 ml/g灌胃。组分AMH-C、AMH-D和AMH-E 不溶于水，因此以DMSO溶解后，采用腹腔注射给药，每只小鼠按0.005 ml/ g注射。以上待测物按在总样品AMH中的比重，配制成相当于同等剂量的总样品AMH。每次给药具体剂量为：总样品AMH为125 mg/kg，AMH-A为25 mg/kg，AMH-B 为56 mg/kg， AMH-C 为14 mg/kg，AMH-D为25 mg/kg， AMH-E为5 mg/kg。

1.3  B(a)P

B(a)P，购自美国Sigma 公司，以玉米油临用时配制。采用1次性腹腔注射给药，剂量为100 mg/kg， 每10 g体质量注射0.10 ml。

1.4  实验方法

按上述分组和处理，各组小鼠给予相应样品，隔日1次，共给予8次。在实验的第8天，阴性对照组腹腔注射等量玉米油，其它组小鼠均1次性腹腔注射B(a)P。

给药结束后，各组小鼠在同等条件下正常饲养，每天观察小鼠活动情况及健康状况，每周称重1次。对注射B(a)P 4个月后死亡的小鼠，均解剖并肉眼检查各脏器肿瘤发生情况。存活小鼠在给予B(a)P 6个月后脱颈椎处死，打开腹腔和胸腔，肉眼仔细检查各脏器是否有肿瘤发生。完整取出肺脏，将小鼠肺脏浸泡于Boin’s液中，24 h后取出以放大镜观察计数每只小鼠肺脏表面的肺腺瘤个数。对出现的肉眼可见其它脏器肿瘤，完整取出并称重，记录发生肿瘤的小鼠数、出现肿瘤的个数及肿瘤发生部位，并对肿瘤进行病理切片观察，同时按下式计算肿瘤发生率和平均每只小鼠荷瘤数。

肿瘤发生率 (%)= 发生肿瘤小鼠数/每组解剖观察的实验小鼠数×100%

平均每只小鼠荷瘤数=肿瘤出现数量/每组解剖观察的实验小鼠数

1.6  统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件，通过Kruskal-Wallis Test秩和检验进行各组小鼠平均荷瘤数统计学检验；用R×C列表资料的Fisher确切概率法分析各组小鼠的肿瘤发生率，α=0.05为检验水准。

 

2  结  果

2.1  B(a)P诱导小鼠主要脏器肿瘤 (肺腺瘤外)发生情况

在注射B(a)P后约4个月，小鼠开始逐渐出现肿瘤，与我们前期的研究报道一致[4]。因此，对注射B(a)P 4个月后死亡的小鼠均进行解剖，肉眼观察并记录除肺腺瘤外的主要脏器实体肿瘤发生情况。见表1。

表1显示注射B(a)P 4个月后的动物解剖结果统计分析，由于排除了前期小鼠因灌胃、样品毒性等非肿瘤原因导致的急性死亡的影响，因此表中各组的实验观察小鼠数目有差异。B(a)P对照组小鼠注射B(a)P后，19只小鼠中有11只共发生了13个肿瘤；而阴性对照组研究观察的18只小鼠没有出现任何脏器实体肿瘤或血性腹水。B(a)P对照组肿瘤发生率、平均每只小鼠荷瘤数与阴性对照组比较均显著增加 (P<0.05)，说明B(a)P能成功诱导昆明种小鼠脏器发生肿瘤，模型建立成功。

当给予不同AMH组分时，各组小鼠的肿瘤发生情况出现了明显差异。AMH-D组和AMH-E组均未出现肺腺瘤以外的实体肿瘤；总样品AMH组20只小鼠中2只小鼠共出现2个实体瘤；AMH-B组18只小鼠有2只共出现3个实体瘤；经统计学分析检验，总样品AMH组、AMH-B组、AMH-D组和AMH-E组的肿瘤发生率和平均每只小鼠荷瘤数均显著低于B(a)P对照组(P均<0.05)， 说明样品AMH、AMH-B、AMH-D和AMH-E能显著抑制B(a)P诱导昆明种小鼠实体瘤的发生，提示其组分中含有对B(a)P致癌性具有预防作用的生物活性物质。

AMH-A组17只小鼠有3只动物共出现4个实体瘤；AMH-C组17只小鼠有5只动物共出现8个实体瘤。这两组小鼠的肿瘤发生率和平均每只小鼠荷瘤数虽低于B(a)P对照组，但差异无统计学意义 (P>0.05)，提示，样品AMH-A和AMH-C中可能残存有少量没有萃取干净的肿瘤化学预防作用生物活性物质，也可能AMH-A、AMH-C组分中含有剂量低或作用不强的抑制肿瘤发生的活性物质。

B(a)P诱导昆明种小鼠出现的脏器实体瘤主要有睾丸肿瘤、肌肉瘤、胸腺肿瘤和肾脏肿瘤、膀胱肿瘤、子宫肿瘤，肿瘤最大的重达20.98 g，经病理检验均为恶性肿瘤。肿瘤发生部位结果见表2。B(a)P诱导的部分小鼠肿瘤见图1。

 

2.2  B(a)P诱导小鼠肺腺瘤发生情况

在实验结束时，将存活的小鼠处死后，检查肺腺瘤发生情况见表3。从表3结果可见，B(a)P注射能诱导小鼠出现较多的肺腺瘤。与阴性对照组比较，B(a)P对照组小鼠肺腺瘤的发生率和平均每只小鼠的荷瘤数显著增加，提示B(a)P成功诱导昆明种小鼠肺腺瘤模型。

与阴性对照组比较，AMH-A、AMH-B、AMH-C和AMH-E组小鼠的肺腺瘤发生率和平均每只小鼠的肺腺瘤荷瘤数显著增加 (P<0.05)，并且显著性高于B(a)P对照组，说明AMH分离出的这4个组分不仅不能抑制B(a)P诱导小鼠肺腺瘤，并且可能含有能促进肺腺瘤发生的成分。总样品AMH组和AMH-D组的肺腺瘤发生率和平均荷瘤数均明显低于B(a)P对照组，说明该真菌提取物AMH中含有预防肺腺瘤发生成分，并且预防B(a)P诱导小鼠肺腺瘤的活性成分主要存在于AMH-D组分中。

有意思的是，在本次研究中我们发现B(a)P诱导小鼠肿瘤存在明显的性别差异。对于雄性昆明种小鼠，B(a)P主要诱发肺腺瘤以外的脏器恶性肿瘤，肺腺瘤发生率低且荷瘤数少；而对于雌性小鼠，则恰恰相反，B(a)P主要诱发小鼠肺腺瘤，脏器的恶性肿瘤发生率低且荷瘤数少。

 

3  讨  论

肿瘤化学预防即采用化学药物或生物提取物预防肿瘤的发生，或使肿瘤分化逆转，从而达到预防恶性肿瘤的目的。肿瘤化学预防研究是肿瘤研究的一个重要领域，世界许多研究机构和科学家都在进行积极探索，已经发现了一些具有重要应用前景的化学物质或生物活性组分，其中的一些已经开始应用于人类肿瘤的预防[6-9]。研究表明，某些生物资源中存在天然的防癌抗癌功效成分[10-12]，是开发肿瘤化学预防药物的重要方向。

真菌提取物AMH是从云南一种特殊真菌植物中提取的。我们前期的Ames试验和小鼠骨髓微核试验均证实，AMH能显著抑制一些强致癌物和致突变物的致突变作用[13-17]。国内外的研究进一步发现，AMH对B(a)P诱导ICR小鼠的肺腺瘤和胃癌，以及AOM诱导C57BL/6J小鼠的结肠癌均有很好的预防作用[4-5]。因此，对AMH进一步分离并进行肿瘤预防作用活性组分追踪，进而开发肿瘤化学预防药物，对保护人类健康具有积极意义。

本研究结果表明，从AMH中分离的组分AMH-D对B(a)P诱导的小鼠肺腺瘤及其它脏器恶性肿瘤均具有较强的抑制作用，其作用显著强于总样品和其它组分，说明AMH的肿瘤化学预防作用活性成分主要存在AMH-D组分中。其它组分虽然也具有一定抑制作用，但作用强度远远低于AMH-D，可能与萃取工艺不能完全分离功效成分有关。

AMH-D对B(a)P诱导小鼠肿瘤的显著性抑制作用，与我们前期在国内以及在美国和澳大利亚的研究结果吻合。我们在澳大利亚研究了AMH的3个组分 (AMH-C、AMH-D、AMH-E)对AOM诱导小鼠结肠癌的预防作用 (注：澳大利亚的研究中AMH-D与AMH-E与本研究样品一致，AMH-C不是本研究的样品)，并对其可能的作用机制进行了探讨，发现，AMH-D对AOM诱导小鼠结肠癌具有显著抑制作用，能显著抑制结肠上皮细胞的增殖[5]，并在AMH的分离组分中具有最高的凋亡指数。在美国，我们采用人类乳腺癌细胞体外培养实验，发现AMH-D能显著抑制多种乳腺癌细胞的增殖和促进癌细胞凋亡 (未发表资料)。我们在国内进行的抗突变试验和体内外抗癌试验也表明，AMH-D具有很好的抗突变作用和体内外抗癌作用。因此，AMH-D对B(a)P诱发小鼠肿瘤的预防作用可能与其具有抑制细胞增殖、促进细胞凋亡和抗突变作用有关，具体作用机制有待于进一步研究探讨。

B(a)P广泛存在于人类的生产和生活环境中，是已知的强致癌物[18]，B(a)P与人类的多种肿瘤发生有关。我们的研究表明，AMH能显著抑制B(a)P的致突变作用和致癌作用，AMH在防治肿瘤方面具有较好的应用前景。本次研究的是提取物AMH的分离组分，AMH成分很复杂，其具体的生物活性成分还不清楚，我们将在后期的研究中，继续采用植物化学分离分析手段，对其肿瘤化学预防作用活性成分进行分离和追踪。

 

参考文献

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收稿日期： 2011-02-24；修订日期：2011-03-29

基金项目： 国家自然科学基金 (30960437)，云南省教育厅重点课题基金 (09Z0029)，云南省科技计划项目 (2009FXL001)

作者简介： 贺小琼(1964-   )，男，湖南衡阳人，教授， 研究方向：癌症化学预防与治疗、营养与食品卫生学研究。 E-mail： hexqcn@ yahoo.com.cn

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