【摘要】  目的探讨蓖麻根提取物对HepG2.2.15细胞株HBsAg和HBeAg表达的影响与抗菌作用。方法采用HepG2.2.15细胞系培养系统检测蓖麻根提取物对HBsAg和HBeAg表达的影响;用平板法对提取物连续稀释测定其最低抑菌浓度。结果蓖麻根两种醇提物孵育HepG2.2.15细胞株72 h后均能抑制HBsAg和HBeAg的表达(与正常对照组比较P<0.05或P<0.01)，其抑制效应呈浓度依赖性，其中50%醇提物在200 mg/L和100 mg/L抑制HBsAg的表达分别为100%和67.2%。蓖麻根提取物的最低抑菌浓度(MIC), 以50%乙醇提取物对金黄色葡萄球菌第3和4株、表皮葡萄球菌、大肠杆菌第2株的抑制作用较强(MIC均为19.5 μg/ml)。其次是金黄色葡萄球菌第2株、大肠杆菌第3株、甲型和乙型链球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌(MIC均为39.1 μg/ml)，而95%醇提物的抑菌作用较弱。结论蓖麻根醇提物具有体外抗乙肝病毒和抑菌作用。

【关键词】  蓖麻根提取物; HepG 2.2.15细胞株; HBsAg; HBeAg; 抗菌作用

　蓖麻Ricinus communis L.，为大戟科植物，又名牛篦子草、红蓖麻、勒菜、草麻。据《本草纲目》记载蓖麻子，气味甘、辛、平，有小毒，主治水癓。以水研二十枚服之，吐恶沫，加至三十枚，三日一服，瘥则止。又主风虚寒热，身体疮痒浮肿，尸疰恶气，榨取油涂之，主偏风不遂，口眼斜，失音口噤，头风耳聋，舌胀喉痹，毒肿丹瘤，汤火伤等。蓖麻叶，有毒，主治脚气不仁，蒸捣裹之，日二三易即消。《中药大辞典》记载蓖麻子主治消肿拔毒，泻下通滞，治痈疽肿毒，瘰疠、喉痹，疥癞癣疮，水肿腹满，大便燥结;蓖麻根主治镇静解痉，祛风散瘀。治破伤风，癫痫，风湿疼痛，跌打疼痛，瘰疠。现代医学研究证明蓖麻子含蓖麻碱(Ricinine)、蓖麻毒蛋白(Ricinin)及脂肪酶。其中蓖麻毒蛋白近年文献报道对小鼠艾氏腹水瘤细胞、L1210白血病、B16黑痣瘤、Lewis肺癌、大肠癌、结肠癌等多种癌细胞有明显作用[1～3]。抗癌机制是经受体介导的内吞方式进入细胞，在细胞内通过逆分泌途径转运至内质网，在胞浆内催化核糖体60S亚基失活，从而抑制蛋白质合成[4～6]。另有研究表明蓖麻子提取物(蓖麻油和蓖麻蛋白)对小鼠有明显的抗生育作用[7]。目前研究仅限于蓖麻子，而对蓖麻根的研究近年无报道，为进一步了解蓖麻根的药理作用，本研究采用HepG2.2.15细胞株培养，观察蓖麻根乙醇提取物对细胞分泌HBsAg与HBeAg表达的影响，并用MTT法观察其对细胞增殖的影响;采用平板法观察蓖麻根乙醇提取物对细菌的抑制作用。结果报道如下。

　　1 材料

　　HepG2.2.15细胞系，购自北京大学医学院第一附属医院病毒研究所;细胞培养基RPMI1640为Gibco BRL产品;胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物工程材料有限公司;谷氨酰胺、G418(Gibco分装)、胰蛋白酶、MTT、DMSO为Amresco公司产品;HBsAg、HBeAg ELISA检测试剂盒为上海容盛生物技术有限公司，批号为20070202和20070407;其余为分析纯试剂。二氧化碳培养箱(MCO3/15AC，日本三洋公司);倒置显微镜(XSB3/IA，上海);96孔细胞培养板(Gorning美国)。菌种：金黄色葡萄球菌4株为广西医科大学提供;白色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌3株、甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、丙型溶血性链球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、铜绿假单孢菌由桂林医学院微生物教研室提供;隔水式电热培养箱GNP-9270(上海精宏实验设备有限公司);蒸气高压灭菌锅MLS-3020(日本日立);水解酪蛋白琼脂为杭州天和微生物试剂有限公司提供。蓖麻采自桂林地区。

　　2 方法

　　2.1 蓖麻根的提取蓖麻根500g粉碎，以6倍95%乙醇加热回流提取3次，每次1 h，合并滤液，旋转蒸发仪浓缩干，置烤箱50℃烤干备用。另取500g蓖麻根，以50%乙醇加热回流提取3次，浓缩与干燥同上。

　　2.2 HepG2.2.15细胞株的培养与分组在RPMI 1 640中加入380 mg/L G418，10%胎牛血清，2 mmol/L谷氨酰氨，100U/ml青霉素和100 mg/L链霉素接种于培养瓶，置37℃、5%CO2的培养箱中常规培养。待细胞约80%融合时，进行传代培养。将对数生长期的HepG2.2.15细胞按104/ml接种于96孔细胞培养板中，每孔180μl，待细胞贴壁(24 h)后加药，分为5组：空白对照组，加入10%FBS的RPMI1 640培养基;蓖麻根95%乙醇提取物各剂量组(400，200，100，50)mg/L;蓖麻根50%乙醇提取物各剂量组(400，200，100，50)mg/L;每个浓度设3个复孔，每孔20 μl，37℃，5 %CO2培养箱孵育72 h后测定培养基上清液中HBsAg 与HBeAg 的含量[8]。

　　2.3 HBsAg与HBeAg含量的测定按照HBsAg，HBeAg的ELISA试剂盒说明，用波长为450 nm 酶标仪测定HepG 2.2.15 细胞株培养基上清液中HBsAg与HBeAg 的吸光度A值，计算蓖麻根提取物对HBsAg、HBeAg表达的抑制率。抑制率(%)=(实验孔P/N-对照孔P/N)÷(对照孔P/N-2.1)×100%[9]。注：P/N为HBsAg或HBeAg的阳性孔A值/阴性孔A值。

　　2.4 MTT法测定药物对细胞的毒性： 用MTT法测定细胞数以反映药物对细胞的毒性。培养结束前4 h，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μl，继续孵育4 h后中止培养，去培养液，每孔加入150μL DMSO，室温下静置5～10 min 后，待formazan 完全溶解后，用酶标仪在570 nm 波长下测定吸光度A值[10]。计算细胞存活率及治疗指数。细胞存活率(%)=实验孔A值/对照孔A值)×100%;治疗指数(TI)=TC50/IC50。注：TC50是实验孔存活细胞为对照孔50%时的药物浓度，当TI>2为有效低毒 ;1

　　2.5 体外抗菌的样品处理蓖麻根50%乙醇提取物用灭菌蒸馏水配制，95%乙醇提取物用DMSO配制，经34.475KPa灭菌10 min，50%乙醇提取物用灭菌的蒸馏水把药物配成系列浓度，再将系列样品浓度以1∶10加入含血清肉汤琼脂培养基(因甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、丙型链球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌营养要求较高，需要血液和血清等营养物质才能生长良好)和含普通肉汤琼脂培养基内径75mm的平板内，使最终两个样品琼脂含药浓度为50，25，1.25，0.625，0.312 5，0.156 3，0.078 1，0.039 1，0.019 5，0.009 8 mg/ml。对照组不加药液，取灭菌蒸馏水和DMSO 1∶10加入血清肉汤琼脂培养基或普通肉汤琼脂培养基中，迅速混匀平板，待凝固后即成。

　　2.6 点种与孵育将不同的细菌用无菌普通肉汤适当稀释后，点种在含药平板及对照平板上，点种量为105 CFU/ml(colony-forming unit，CFU菌落形成单位)0.1 ml[12，13]。置37℃培养箱中培养18 h。

　　2.7 统计学处理数据±s表示，采用SPSS10.0统计分析软件，对组间实验数据进行方差分析以及Dunnett两两比较。

　　3 结果

　　3.1 蓖麻根50%和95%乙醇提取物对HepG 2.2.15 细胞株HBsAg与HBeAg表达的影响 结果表明蓖麻根50%和95%乙醇提取物各剂量组孵育HepG 2.2.15 细胞株72 h后均有不同程度地抑制HBsAg与HBeAg表达，并呈现浓度依赖关系，见表1～2。50%乙醇提取物HBsAg的IC50为66.45mg/L,TI=6.67; HBeAg为292.63mg/L,TI=1.53。95%乙醇提取物HBsAg的IC50为115.18mg/L,TI=10.85; HBeAg为444.56mg/L,TI=2.80。提示50%和95%乙醇提取物对HBsAg的表达抑制作用明显。

　　3.2 蓖麻根50%和95%乙醇提取物抗菌作用 在加入不同浓度50%和95%蓖麻根乙醇提取物的平板上，经37℃培养18h，显微镜下观察有无细菌生长，以无细菌生长孔所含最低抗菌药物的浓度即为该药的最低抑菌浓度(MIC) [14，15]。并将各无菌生长的培养物3个浓度转接至相应培养基的琼脂平板上，培养24 h后取出观察结果，以无细菌生长的最低药物浓度为最低杀菌浓度(MBC)。结果见表3，对供试的10种细菌在高于MIC浓度时完全抑制细菌生长，其中以50%乙醇提取物的抑菌作用明显。表1 蓖麻根50%乙醇提取物对HepG2.2.15细胞株HBsAg、HBeAg表达的影响表2 蓖麻根95%乙醇提取物对HepG2.2.15细胞株HBsAg、HBeAg表达的影响表3 蓖麻根乙醇提取物对供试菌株的抗菌(MIC)和(MBC)作用结果

　　4 讨论

　　乙型肝炎是我国感染人数最多、危害最大的传染病。目前我国约有1.2亿人是乙型肝炎病毒(HBV)携带者，慢性乙肝患者约有3 000万。乙型肝炎如果得不到有效控制，进一步发展，将会演变成为肝硬化和肝癌，使患者的生活质量下降，寿命缩短[16]。目前对于乙型肝炎的治疗尚无疗效确切药物，寻找安全有效的抗HBV药物已成为当前医药工作者的一项迫切任务。随着转染 HBV-DNA 的细胞株的建立，并能稳定地分泌 HBsAg、HBeAg 和完整的Dane颗粒，是目前国内外公认和常用的体外评价抗HBV药物的细胞模型。现已将其用于抗 HBV 药物的初步筛选，该方法简便易行，可以为抗 HBV 药物的筛选提供一定信息[17]。

　　本实验以HepG2.2.15细胞模型，采用ELISA法检测蓖麻根乙醇提取物在作用 HepG2.2.15细胞72 h后上清液中HBsAg和HBeAg的含量。结果表明，50%和95%醇提物在作用 HepG2.2.15细胞72 h后，均可抑制HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg和HBeAg的表达(P<0.05，P<0.01)。其中以50%醇提物抑制HBsAg的表达作用更明显，且随着药物浓度增加其抑制作用逐渐增强，呈现明显的量效反应关系。从对细胞毒性分析，除50%乙醇提取物抑制HBeAg表达IC50为292.63mg/L,TI=1.53，属为低效低毒外，其余均为有效低毒。这说明蓖麻根提取物可抑制HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg和 HBeAg的表达，提示其在体外具有抗HBV作用。

　　体外抗菌实验结果：本试验采用平板法观察蓖麻根50%和95%醇提物对金黄色葡萄球菌4株、白色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌3株、甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、丙型链球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌的抑菌作用(MIC)，结果表明，50%乙醇提取物对金黄色葡萄球菌第3和4株、表皮葡萄球菌、大肠杆菌第2株的抑制作用较强(MIC均为19.5μg/ml)。其次是金黄色葡萄球菌第2株、大肠杆菌第3株、甲型和乙型链球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌(MIC均为39.1μg/ml)，而95%乙醇提取物对上述细胞的抑菌作用不及50%乙醇提取物。有关蓖麻根的抗乙肝和抗菌作用的有效单体成分值得进一步研究。

【参考文献】
  　　[1] 戎隆富，王新建，秦德安.蓖麻毒素研究进展[J].安徽预防医学杂志，1999，5(2)：238.

　　[2] Chakravartula SV, Guttarla N.Biochemical properties of ricin in immature castor seed[J].Nat Prod Res.2008，22(7):600.

　　[3] 邹立波.蓖麻毒素与肿瘤治疗[J].国外医学·临床生物化学与检验学分册，2001，26(6)：290.

　　[4] 邹立波，詹金彪.蓖麻毒素的提取及其抗肿瘤作用研究[J].浙江大学学报(医学版)，2005，34(3)：217.

　　[5] Camargo SE, Camargo CH, Hiller KA, et al.Cytotoxicity and genotoxicity of pulp capping materials in two cell lines[J].Int Endod J.2009，42(3):227.

　　[6] Brinkworth CS, Pigott EJ, Bourne DJ.Detection of intact ricin in crude and purified extracts from castor beans using matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry[J].Anal Chem，2009 ，81(4):1529.

　　[7] 秦小娜，甘明哲，高 平.蓖麻提取物对鼠抗生育作用的实验的研究[J].四川动物，2006，25(1)：176.

　　[8] 唐庆年，冯 梅，龚受基.雪灵芝提取物对HepG2.2.15细胞株HBsAg与HbeAg表达的影响[J].中药材，2008，31(8)：1212.

　　[9] 钟 森，王升启，张定风，等.不同基因区反义寡核酸抑制乙型肝炎病毒基因表达的比较[J].中华传染病杂志，1998，16(1)：11.

　　[10] 徐叔云.药理实验方法学，第3版[M].北京：人民卫生出版社，2002：1757.

　　[11] 聂红明，陈建杰，高月求，等.槐定碱体外抗乙肝病毒的实验研究[J].北京中医，2007，26 (10):678.

　　[12] 李 宏,姜怀春.贯叶连翘总提取物对致病细菌的抗菌作用[J].广西植物,2007,27(3)：466.

　　[13] Sahare KN, Anandharaman V, Meshram VG, et al.In vitro effect of four herbal plants on the motility of Brugia malayi microfilariae[J].Indian J Med Res.2008，127(5):467.

　　[14] 赵铁华，邓淑华，杨鹤松，等.黄芩茎叶活性部位抗菌作用的研究[J].中国药理学通报，2007，23(7)：882.

　　[15] 杨 洁，刘 萍，武晓玉.苦参提取物对表皮葡萄球菌的体外抗菌活性研究[J].中华医院感染学杂志，2007，11(17):1357.

　　[16] 徐 巍，苏乐群，李宏建.乙肝治疗药物的研究进展及临床评价[J].中国医院药学杂志，2008，28(9)：737.

　　[17] 邹宇宏，杨 雁，吴 强.黄芪提取物的体外抗乙肝病毒作用[J].安徽医科大学学报，2003，38(4):267.