【摘要】  目的观察益气养阴方的含药血清与低浓度的顺铂(DDP)体外共同作用于肝癌HepG2细胞后，对HepG2细胞Survivin表达的影响，从而探讨本益气养阴方与化疗合用治疗肝癌的协同增效作用的相关机制。方法运用血清药理学方法制备大鼠的益气养阴方的含药血清，分为中药含药血清组、化疗药物DDP组和中药含药血清+DDP组，并设不含药的空白大鼠血清为对照组，分别作用于HepG2细胞，应用SP免疫细胞化学染色法及western-blot检测各组细胞24h、48h、72h后Survivin蛋白的表达变化。结果各组作用24，48，72 h后，中药含药血清组HepG2细胞Survivin蛋白的表达量无明显变化(与对照组相比，P>0.05);DDP组HepG2细胞Survivin蛋白的表达量逐渐升高(与对照组相比，P<0.05)，且具有时间依赖性;而中药含药血清+DDP组细胞Survivin蛋白的升高水平与DDP组相比明显降低(P<0.05)。结论益气养阴方含药血清可能通过抑制DDP诱导HepG2细胞中凋亡抑制蛋白Survivin的表达而降低HepG2细胞对化疗的抵抗，这可能是本方与化疗合用增效的重要机制之一。

【关键词】  中药; 含药血清; HepG2细胞; 顺铂; Survivin

　益气养阴方是我们多年临床应用的有效验方，长期的临床实践证明其对原发性肝癌有良好的辅助治疗作用，尤其是与介入化疗等结合，能提高化疗的疗效，延长患者的生存期和改善生活质量，其作用的机制尚未被充分阐明。本研究通过血清药理学的方法，观察本方的含药血清联合化疗药顺铂(DDP)对肝癌HepG2 Survivin表达的影响，从而探讨本益气养阴方与化疗合用治疗肝癌的协同增效作用的相关机制。

　　1 材料与仪器

　　1.1 动物和细胞株雄性SD大鼠，体质量(253±18)g，由苏州大学实验动物中心提供。HepG2人肝癌细胞株购自上海生化研究所，本实验室自行保存传代备用。

　　1.2 药物和试剂RPMI1640培养基、小牛血清购自Gibcol公司;兔抗人survivin多克隆抗体和鼠抗人β-actin单克隆抗体为Neomarkers公司产品;SP免疫化学检测试剂盒、羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG购自北京中山生物公司;苯甲基磺酰氟(PMSF)和Aprotinin购自Roch公司;ECL显影试剂为Pierce 公司产品;DDP购自江苏豪森药业公司。其他化学试剂均为进口或国产分析纯产品。益气养阴方中药饮片购于苏州大学附属第一医院中药房。

　　1.3 仪器和设备荧光倒置显微镜(日本Olipus公司);CO2培养箱(德国Heraeus公司);超净工作台(苏州净化设备厂);分析天平(美国sartorius公司);纯水装置(美国Miliproe公司);台式高速低温离心机(德国Beckman公司);垂直电泳仪(北京六一仪器厂);半干转移仪(美国Bio-Rad公司);恒温摇床(中国科学院武汉科学仪器厂);GIS凝胶成像分析系统(美国UVP公司)。

　　2 方法

　　2.1 药物制备及剂量益气养阴中药复方由太子参、生黄芪、炒白术、女贞子、山茱萸生药按组方比例组成。将上述中药饮片置煎煮容器内，加相当药材量5倍的冷水浸泡1 h，煮沸30 min，过滤;再加3倍量水继续煎煮20 min，过滤，合并两次滤液，浓缩后，用蒸馏水稀释成含生药0.75 g/ml的水煎剂，然后分装，4℃保存待用。根据人和动物体表面积折算的等效剂量比率表，设定灌胃的剂量为30 g/(kg·d)(相当于成人常用临床剂量的6倍)。对照组给予等量生理盐水。

　　2.2 含药血清的制备将大鼠随机分为空白对照组和含药血清组，每组8只，含药血清组将上述剂量的中药水煎剂分成每日上午9时和下午15时两次灌胃给药，空白对照组给予等量生理盐水，采血前连续灌胃3天，末次灌胃前禁食12 h，在末次给药后1 h时采血[1]。采血方法：戊巴比妥钠麻醉，无菌条件下自下腔静脉采血，静置4 h，4℃，离心3 000 r/min×20 min，分离血清，同种条件药物血清混匀，56℃， 30 min灭活，-20℃保存备用。采集的血清分为空白对照组血清和含药组血清。

　　2.3 细胞培养及处理配置RPMI 1640培养基：取NaHCO3 2g，谷氨酰胺0.6g，Heps 1g，置烧杯中，加ddH2O 700～800 ml，用磁力搅拌器充分搅拌使其完全溶解，调节pH 值在7.2～7.4，加适量ddH2O 至1 000 ml，过滤除菌，备用。细胞用含10%小牛血清的RPMI 1 640常规培养，实验所用细胞均处在对数生长期。

　　2.4 实验分组分为①空白对照组：加入10% 空白对照组血清及等量生理盐水;②含药血清组：加入10%含药组血清及等量生理盐水;③DDP组：加入2 μg/ml DDP和10%空白对照组血清;④DDP组+含药血清组：加入2 μg/ml DDP和10%含药组血清。

　　2.5 检测凋亡抑制蛋白survivin的表达

　　2.5.1 SP法免疫细胞化学染色法取对数生长期的HepG2细胞，接种于6孔板内，爬片，用含2%H2O2的50%甲醇中固定，风干，血清封闭，加入survivin一抗，4 C过夜，加二抗，DAB显色。光学显微镜下观察结果。用Imagepro-Plus软件分析计算照片的光密度值以代表survivin蛋白表达量。

　　2.5.2 Western blot技术检测Survivin的蛋白表达三去污剂法配制三去污剂，临用前加入100 μg/ml 苯甲基磺酰氟(PMSF)和1μg/ml Aprotinin，预冷后加入细胞表面(5ul/cm2)，冰上作用30 min，收集裂解液，离心取上清，置于-70°C下保存备用。细胞总蛋白定量于50 μg，SDS-PAGE凝胶电泳，半干法电转移至硝酸纤维素膜，丽春红染色证实转移成功，一抗(1∶1 000稀释兔抗人多克隆Survivin抗体，1∶2 000稀释鼠抗人β-actin单克隆抗体)封闭过夜，二抗(1∶5 000稀释羊抗兔IgG，羊抗鼠IgG)孵育1 h，化学发光法显色，洗片。结果经计算机扫描后，GIS凝胶成像系统计算净面积值代表蛋白表达量，根据(目的蛋白净面积值)/(β-actin净面积值)计算出各目的蛋白的相对含量(%)。

　　2.6 统计学方法实验结果以±s表示。统计学分析采用SPSS13.0软件包。数据比较采用one-way ANOVA检验。P<0.05被认为在统计学上有差异，P<0.01被认为有显著统计学差异。

　　3 结果

　　3.1 免疫细胞化学技术检测survivin蛋白在胞浆的表达在用药后72 h ，Survivin蛋白在空白对照组和含药血清组的表达均很弱，加入DDP后，Survivin的表达明显增强(与空白对照组相比较，P<0.01)，而加入含药血清+DDP后Survivin的表达较单用DDP减弱，两者具有统计学差异(P<0.05)。结果见表1及图1～4。表1 Survivin蛋白在胞浆的表达

　　3.2 Western blot技术检测Survivin蛋白的表达在含药血清和化疗药物作用下，各组细胞中Survivin蛋白相对表达量的变化如表2和图5所示。随着作用时间的延长，空白对照组和含药血清组Survivin蛋白的表达量无明显变化(P>0.05)。而在DDP组，Survivin蛋白的表达量随给药时间的延长而逐渐增加，且具有时间依赖性(各时相相比，P<0.05)。在含药血清+DDP组，虽然Survivin蛋白的表达高于空白对照组(P<0.05)，但明显低于相应时间的单用DDP组(P<0.05)。有代表性的Western blot分析图见图6。表2 含药血清和化疗药物作用下survivin蛋白相对表达量的变化图1 空白对照组Survivin图2 含药血清组Survivin 蛋白的表达(200×) 蛋白的表达(200×)图3 加DDP后72h时图4 含药血清+DDP 作用 Survivin的表达(200×)72h时Survivin的表达(200×)

　　4 讨论

　　益气养阴法是我们多年临床配合化疗等治疗恶性肿瘤的主要治法，长期的临床实践证明其对多种消化道肿瘤具有良好的辅助治疗作用，尤其对于原发性肝癌与化疗结合，能提高化疗的疗效，延长生存期和改善生活质量，增加化疗的敏感性可能是其作用的机理之一。益气养阴的代表方组成：太子参、生黄芪、炒白术、女贞子、山茱萸。基本方义：太子参、生黄芪、炒白术益气健脾，女贞子、山茱萸滋养肝肾，临床运用时可随证加减。化疗后患者常出现头晕乏力、气短懒言、纳呆便溏、发热盗汗、心烦口干、舌淡苔少、脉细等症状和体征，表现出气阴两虚之证为主，故治疗时选用健脾益气，滋水涵木之法，以补气血生化之源，与化疗共同发挥扶正祛邪作用。我们在先期的研究发现益气养阴方的含药血清单独作用于肝癌HepG2细胞未见到抑制增殖和诱导凋亡现象，但含药血清与化疗药共同作用后能增强化疗药诱导的肝癌HepG2细胞凋亡。故我们进一步检测本方与化疗药DDP共同作用后HepG2细胞Survivin的表达变化，从而探讨本益气养阴方增效作用的相关机制。图5 含药血清和化疗药物作用下survivin蛋白相对表达量的变化图6 含药血清和化疗药物作用下Survivin蛋白的表达　　1994年由Clem等在棒状病毒的研究中发现了一类分子水平的凋亡调节因子(IAPs) ，IAPs为天然的caspase抑制物[2]。Survivin为人类IAP家族成员(hIAP)之一，Survivin蛋白的分子骨架和立体构型在此家族中是独一无二的，Survivin只含有一个BIR基序，它能抑制Fas，Bax，caspase及抗癌药物诱导的肿瘤细胞凋亡，主要通过抑制caspase级联反应下游的caspase 3、caspase7的活性或可能通过促进caspase的降解来抑制凋亡信号的传递，发挥其抗凋亡作用[3]。在发育成熟的正常肝组织及癌旁组织中基本不表达Survivin基因，但在肝癌肿瘤组织中特异性高表达[4]。另有报道在肝癌患者中，Survivin的表达与凋亡的发生呈明显的负相关，而且Survivin的高表达是肝癌患者高复发率和低存活率最有效的临床生物标志之一[5]。除在体内实验中发现肿瘤细胞中Survivin表达外，体外实验中在各种肿瘤细胞系中也检测到Survivin的表达，对美国国立癌症研究中心使用的60种肿瘤细胞系的测试分析结果表明，Survivin在60种肿瘤细胞系中普遍表达。

　　本研究通过SP法免疫细胞化学染色法和Western blot技术检测各组细胞Survivin的蛋白表达结果发现，DDP作用于HepG2细胞后，细胞Survivin蛋白的表达量随给药时间的延长而逐渐增加，提示低浓度化疗药物DDP可诱导HepG2细胞中Survivin表达，且具有时间依赖性(各时相相比，P<0.05)。这与已有的文献报道[6，7]是相一致的，表明化疗药诱导肝癌HepG2细胞Survivin表达升高可能是肝癌HepG2细胞对化疗药产生耐药的机制之一。

　　本研究发现，随着作用时间的延长，空白对照组和含药血清组Survivin蛋白的表达量无明显变化(P>0.05)，说明含药血清单独作用对Survivin蛋白的表达无明显影响。而中药含药血清与DDP共同作用于肝癌HepG2细胞后，虽然Survivin蛋白的表达高于空白对照组(P<0.05)，但明显低于相应时间的DDP组(P<0.05)。表明中药含药血清可使DDP诱导肝癌HepG2细胞Survivin表达的作用减弱，中药含药血清可能通过抑制化疗药物诱导的凋亡抑制蛋白survivin的表达，而降低细胞凋亡的阈值，从而增加了肝癌细胞对化疗药诱导其凋亡的敏感性。已有报道Survivin mRNA的表达与肝癌细胞的高增殖和低凋亡指数有关，而且利用Survivin的反义寡核苷酸转染肝癌细胞株HepG2后，能下调Survivin的表达，诱导肝癌细胞凋亡，从而抑制细胞增殖，增加肝癌细胞对化疗的敏感性[8，9]。本研究显示本中药方有类似的作用，这可能是本方与化疗合用治疗肝癌增效的作用机制之一。

　　本实验条件下的中药含药血清可能参与了化疗药DDP诱导肝癌HepG2细胞Survivin表达的某种调控机制，进而抑制DDP诱导HepG2细胞中Survivin的表达，可起到促进肝癌细胞凋亡的作用。由于DDP诱导肝癌细胞Survivin表达的调控机制尚不清楚，中药是如何参与这一调控过程有待深入研究。

【参考文献】
  　[1] 黄 敏，杨坤杰.中药血清药理学的研究方法及其改进思路[J].湖北中医杂志，2006，28(5)：24.

　　[2] Clem RJ,Miller LK.Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap[J].Mol Cell Biol，1994 ;14(8):5212.

　　[3] Shin S，Sung BJ，Cho YS，et al.An anti-apoptotic protein human survivin is a direct inhibitor of caspase-3 and caspase-7[J].Biochemistry，2001; 40(4):1117.

　　[4] Ikeguchi M， Ueta T， Yamane Y， et al.Inducible nitric oxidesynthase and survivin messenger RNA expression in hepatocellular carcinoma[J].Clin Cancer Res，2002，8(10): 3131.

　　[5] Ikeguchi M， Hirooka Y，Kaibara N.Quantitative analysis of apoptosis-related gene expression in hepatocellular carcinoma[J].Cancer，2002，95(9):1938.

　　[6] 王 群，戴宗晴，刘志苏，等.人肝癌多药耐药细胞株Survivin蛋白的表达及意义[J].山东医药，2005,45(9):1.

　　[7] 王俊萍，叶红军，杜意平，等.丝裂霉素诱导肝癌细胞Survivin基因表达的研究[J].临床肝胆病杂志，2005，21(3)：145.

　　[8] 王 颖，王家龙.生存素反义寡核苷酸诱导肝癌细胞凋亡的实验研究[J].中华消化杂志，2003，23(1)：11.

　　[9] 陈 涛，田伏洲，蔡忠红，等.Survivin反义寡核苷酸诱导肝癌细胞凋亡及细胞结